甲基化特异性PCR过程中的影响因素分析

甲基化特异性ＰＣＲ过程中的影响因素分析DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。它是指在DNA甲基转移酶

的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上，常见的DNA甲基化发生在DNA 链上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基间的共价结合，即形成5甲基胞嘧啶（5mC），哺乳动物基因组中约70%的5mC存在于CpG二联核苷。DNA甲基化影响着基因的转录表达，因此它在基因的表达调控、细胞增殖、分化发育等方面起着重要作用，并与肿瘤的发生密切相关。但DNA甲基化的检测比较困难，近年来随着技术的进步，检测甲基化的方法也逐渐多起来，甲基化特异性PCR （methylation-specific PCR，MS-PCR）就是其中一种快速敏感的甲基化检测方法。其特异性高，操作相对简便，费用和耗时都较小，可以进行超微量分析和同源基因分析。但在实验过程中也有很多因素可影响甲基化特异性PCR的分析结果。

进行MS-PCR的第一步是提取目的DNA，这一步的关键是提取的基因组DNA应是完整的，纯度要尽量高，要求A260/A280在1.8~2.0之间，并且要准确测定DNA的浓度以利于下一步的修饰。

MS-PCR的第二步是进行亚硫酸氢钠（Sodium bisulfite）修饰。亚硫酸氢钠对甲基化和非甲基化胞嘧啶的化学活性不同，它可将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，尿嘧啶经PCR扩增克隆转变为胸腺嘧啶，而产生A-T配对，但亚硫酸氢钠不能转变甲基化的胞嘧啶，这样甲基化状态不同的DNA片段就可转化为有碱基序列差异的2个片段，从而能被鉴别出来。亚硫酸氢钠修饰过程中的许多因素都可能影响MSP。主要应注意以下几方面：（1）所有试剂需在使用前新鲜配制。（2）亚硫酸氢钠溶液的pH值须用3MNaOH精确调至5.0，否则会影响后续的纯化吸收，使用亚硫酸氢钠处理DNA时还应注意避光。（3）DNA模板的量不一定十分精确，可稍多，因为在纯化回收步骤中可能有丢失，有研究用到4 ?滋g DNA[1]，但DNA的量也不能过多，否则会导致DNA处理不完全。（4）亚硫酸氢钠修饰DNA时，反应温度控制在50~55 ℃，修饰时间掌握在8~16小时，一般在10小时以上，修饰时间过短使修饰不完全，修饰时间过长（超过16小时）会使甲基化胞嘧啶也转化为尿嘧啶并且使DNA模板的破坏加剧。（5）回收修饰后的DNA 时，如果模板DNA较少，可加入适量鲑鱼精DNA或糖原作为载体促进DNA沉淀。（6）在用双蒸水或TE buffer溶解回收修饰后的DNA前，要使其内的乙醇充分挥发完。（7）修饰后的DNA为单链易降解，-20 ℃贮存不能超过2个月，最好是修饰后短期内使用，若要贮存建议最好放入-70 ℃冰箱中。

亚硫酸氢钠修饰DNA操作好可保证约99%的未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变[2]，但在修饰过程中难免会造成模板DNA的部分降解。

MS-PCR的第三步是进行PCR，这一步影响因素最多，除了遵循一般PCR 的基本原则，还有一些是MS-PCR所需要特别注意的。（1）引物问题：引物的特异性是影响MS-PCR成败的最关键因素。MS-PCR的引物设计除了尽量遵循普

通PCR引物设计的原则外还应充分结合MSP的自身特点。进行化学修饰后甲基化和非甲基化DNA产生了序列差异，基于这种序列差异MS-PCR至少应设计两对引物——甲基化引物（M，扩增甲基化DNA）和非甲基化引物（U，扩增非甲基化DNA）。若想检测化学修饰的效率还可设计一对野生型引物（W）用于扩增未经化学修饰的DNA（包括甲基化和非甲基化DNA）。一般，MS-PCR的引物大小应约20~21 bp，Tm值接近，每对引物的扩增产物大约100~200 bp，两对引物的3’末端要尽可能不同。避免引物内部二级结构的产生。非甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤，反向引物不含胞嘧啶。由于CpG岛多位于基因的启动子区域，所以最佳选择引物的区域是接近转录起始位点的富含G-C的区域。在筛选新的甲基化基因时可用在线MethPrimer软件在线设计引物[3]，但如果研究的不是新的基因，又是初涉及MSP者建议最好参考文献引物进行研究。参考文献引物时注意与GeneBank中的相应序列进行比对，看是否存在出入。（2）PCR反应：MS-PCR反应体系的成分与普通PCR一样，特别应注意Mg2+浓度、PCR 缓冲液及Taq酶的选择。Mg2+浓度一般在2.0~2.5 mmol/L，缓冲液质量应较高，Taq酶有建议用TaKaRa公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa LA Taq with GC Buffer[2]。我们使用TaKaRa公司的TaKaRa Taq Hot Start Version也可取得较好效果。只要反应体系正确，反应条件适合，一般热启动酶也可以使用，但应使用质量较好的Taq酶。由于修饰后的DNA容易降解和形成二级结构，所以采用热启动法进行MS-PCR扩增很重要。MS-PCR的预变性温度最好为95 ℃，一般5~10 min，变性温度为95 ℃，一般30 s~1 min。退火温度可根据引物的退火温度在小范围内尝试，有条件可作降落PCR以达到最佳扩增条件，并提高产物特异性。MS-PCR的阳性对照应包括甲基化的阳性对照和非甲基化的阳性对照，阴性对照是未加模板DNA的空白对照。理想的结果是甲基化和非甲基化的阳性对照阳性，阴性对照阴性[1]。如果出现无扩增产物和有非特异性扩增产物的情况，在确保引物和模板没有问题的前提下，调整退火温度很重要。

参考文献：

[1] 杨少辉，戴冬秋.甲基化特异性PCR技术的分析及改良[J]. 肿瘤研究与临床，2006，18(9)：594.

[2] 冯景，周有利，张吉才，等. 甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施[J].检验医学，2006，21(4)：437.

[3] Long CL，Rajvir DM.Designing primers for methylation PCRs[J]. Bioin-formatics，2002，18：1427.