Alcalase水解猪皮胶原蛋白的研究

进一步考查。
度 60g/L，水解温度 60℃，酶与底物比 25μL/g 蛋白，
2.2 正交试验确定酶解猪皮的最佳水解条件
pH 值 8.0。
考虑到各因素的相互依赖和相互制约，导致对酶 2.3 Alcalase 水解猪皮的水解曲线
解效果的影响，进行正交试验以确定各参数的最佳组
影响酶解蛋白水解程度的另一重要因素为反应时
B C D 降解率 水解度
1 1 1 71.5
7
2 2 2 88.7 9.9
3 3 3 90.3 10.9
1 2 3 86.8 9.3
2 3 1 92.3 12.8
3 1 2 69.4 7.3
图 5 降解率和水解度随时间的变化
由图 5 可以看出，随着水解时间的延长，水解度 和降解率不断增加，但当水解时间为 4 小时后，再延 长水解时间，水解度和降解率增加很慢，所以水解时 间可取为 4h，此时降解率达到 97.3％，水解度达到 13.1 ％。
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《现代食品科技》
Modern Food Science and Technology
Vol.21 No.2(总 84)
1.3.2 蛋白质水解度（HD）测定：
由图 2 可以看出，在 pH 值为 8.0 的条件下水解猪
取适量水解物的离心上清液，然后用甲醛滴定法 皮胶原蛋白时，降解率和水解度的最佳水解温度并不
60
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由图 4 可以看出，随着底物浓度的增加，降解率
综合考虑水解度和降解率两个因素及以上极差分
逐渐下降，而水解度则出现一个最佳值，其原因尚需 析结果，从正交试验得到的最佳水解条件为：底物浓
参考文献
7
3 1 3 2 89.3 11.2
8
3 2 1 3 70.3 6.5
9
3 3 2 1 88.4 8.4
表 3 极差分析结果
A 极差来
源 降解 水解 率度
B
C
D
降解 水解 降解 水解 降解 水解
率度率度率 度
K1 250.5 27.8 247.6 27.5 211.2 20.8 252.2 28.2
Keyworlds: Alcalase; pigskin; hydrolyzing conditions
动物皮肤最重要的一个应用就是制革，但是由于 猪皮本身的质地不佳，目前在皮革工业中已经很少采 用猪皮，这就造成了猪皮的大量积压。现在市售带皮 猪肉已经非常普遍，但猪皮直接食用消费量十分有限。
猪皮占猪胴体体重的 10%[1]。目前，我国是世界 上第一的猪饲养国与消费国，所以每年通过饲养生猪 得到的猪皮很多，急需找到一种消费量大的综合利用 猪皮的新方法。猪皮中约含水分 70％～75％［2］，蛋白 质 21％~23％，脂肪 1％，灰分 0.5％。猪皮中的蛋白 质以胶原蛋白为主，含量为 87.7%可考虑开发其食品 方面的用途。蛋白质和肽类功能因子是保健食品发展 的一个非常重要的方向，用猪皮作为原料开发胶原蛋 白肽类保健食品，可以为猪皮的开发和利用找到一条 新的出路。
[1] 李 中 东 . 浅 谈 猪 皮 的 组 成 和 利 用 [J]. 肉 类 研 究 ,1995, （2）:33-34
[2] 赵胜年.酶解鲜猪皮提取水解胶原蛋白的研究[J].食品工业 科技,1998(5):16-17
[3] 赵新淮,冯志彪.蛋白质水解物水解度的确定[J].食品科学, 1994, （11）:65-67
100
14
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12
80
10
70
降解率
水解度
8
60
6
50
50
52
54
56
58
60
温度/℃
图 3 酶与底物比对 Alcalase 水解性能的影响
由图 3 可以看出，随着酶与底物比的增加，降解 率和水解度都呈上升趋势，但是当酶与底物比达到 25µL/g 以后，再增加酶与底物比降解率和水解度的增 加都不是非常显著，这可能是因为酶与底物比高于 25µL/g 以后酶在底物表面的吸附作用已达到饱和，多 出的酶不能在底物上起作用之故。考虑到成本问题， 我们选择酶与底物比为 25µL/g。 2.1.4 底物浓度对猪皮降解度和水解率的影响
水解条件：水解温度 60℃；酶与底物比 25µL/g；
pH 值 8.0；水解时间 1h。实验结果如图 4 所示。
14 94
92
12
90
88
10
86
降解率
8
84
水解度
82
6
80
20
40
60
80 100 120
底 物 浓 度 /(g/L)
图 2 温度对 Alcalase 水解性能的影响
图 4 底物浓度对 Alcalase 水解性能的影响
摘要：研究了 Alcalase 水解猪皮制备胶原蛋白寡肽时影响水解效果的各种因素。确定了 Alcalase 水解猪皮的最佳水解条件：pH 值 8.0，水解温度 60℃，酶与底物比 25µL/g，底物浓度 60g/L，水解时间 4h。在此最佳水解条件下，猪皮的降解率可达到 97.3％，水 解度可达到 13.1％。
关键词：Alcalase；猪皮；水解条件
Study of the Hydrolysis of Pigskin with Alcalase
Ban Yu-feng, Zhu Hai-feng, Zhao Wei (Shenyang University of Technology College of Petrochemical .Engineering, Liaoyang111003, China)
1 实验
1.1 实验原料及药品 枯草杆菌（Alcalase）碱性蛋白酶：食品级（2.4L），
丹麦 NOVO 公司出品；新鲜猪皮：市售；其它试剂为 国产试剂。
收稿日期：2004-12-29
作者简介:班玉凤(1969-),女,硕士,讲师.研究方向为生物酶催化
1.2 实验仪器 精密酸度计：pHS-2 型，上海雷磁仪器厂；台式
合。
间，在以上最佳水解条件下，考察了猪皮降解率和水
按正交表 L9(34)设计试验，水解时间为 1h，以水 解度和降解率为测定指标，拟定出实验方案（见表 1）
解度随时间的变化情况，结果如图 5 所示。
来考查 4 个因素对水解效果的影响（根据单因素分析
确定的最适条件来确定相应的水平数），结果如表 2、
96
2.1 水解条件的考察
范围。
2.1.1 pH 值对猪皮降解率和水解度的影响
2.1.3 酶与底物比对猪皮降解率和水解度的影响
水解条件：酶与底物比 25µL/g；底物浓度 60g/L；
水解条件：水解温度 60℃；底物浓度 60g/L；水
水解时间 1h；温度 55℃。实验结果如图 1 所示。
解时间 1h；pH 值 8.0。实验结果见图 3。
［3］进行测定（水解度［4］定义为在水解过程中打开的
一致。降解率在 55℃时达到最佳值，温度超过 55℃
肽键占蛋白质肽键总数的百分比）。
时，降解率开始下降。但是水解度随着温度的升高，
2 结果与讨论
一直在缓慢增加。但二者在考查的温度范围内总体上 变化不大，因此，50~60℃为 Alcalase 的适宜水解温度
由图 1 可以看出，降解率和水解度随着 pH 值的
增大先升后降，即存在着最佳的 pH 值。Alcalase 是一
种碱性蛋白酶，一般来说在碱性条件下，底物蛋白和
酶蛋白的构象最有利于它们之间的诱导楔合，所以在
碱性条件下酶的活性最高。但是当水解体系的 pH 值
进一步增加时，超出了酶蛋白的适应范围，会导致酶
100
14
100
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12
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12
降解率/% 水解度/ %
降解率/% 水解度/ %
80
10
70
降解率
水解度
8
60 6
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6
pH8值
10
10
80
降解率
8
70
水解度
6
60
4
0
10
20
30
40
50
酶与底 物比 /(μL/g)
降解率/% 水解度/%
降 解 率 /% 水 解 度 /%
图 1 pH 值对 Alcalase 水解性能的影响
《现代食品科技》
Modern Food Science and Technology
中图分类号：TQ645.9＋9；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2005)02-0059-020
Vol.21 No.2(总 84)
Alcalase 水解猪皮胶原蛋白的研究
班玉凤，朱海峰，马君昌 (沈阳工业大学石油化工学院 辽宁辽阳 111003）
蛋白结构破坏，活性下降。
由图 1 还可以看出，对于胶原蛋白其降解率和水
解度的最佳 pH 值不一致。综合考虑降解率和水解度
两个指标，可选择 pH=7.0~8.5 为适宜调控范围。
2.1.2 温度对猪皮降解率和水解率的影响
水解条件：酶与底物比 25µL/g；底物浓度 60g/L；
水解时间 1h；pH 值 8.0。实验结果如图 2 所示。
Abstract: Alcalase was used to hydrolyze pigskin, and the factors effecting pigskin hydrolysate harvest, such as the amount of Alcalase , temperature, pH and time of hydrolyzing, were studied. The best conditions of the hydrolysis of pigskin were: pH8.0, hydrolyzing temperature 60℃,ratio of Alcalase 25µL/g, concentration of substrate 60g/L, total hydrolysis time 4h. Under these conditions the degradation percentage of the pigskin can reach 97.3%, while the hydrolysis degree of collagen protein (i.e., the ratio of the peptide bonds cleavaged/total peptide bonds in protein) can reach 13.1%
离心机：80-1 型，江苏省金坛市医疗仪器厂；超级恒 温水浴：501 型，上海市实验仪器厂；水夹套式三口 玻璃发酵罐：250ml，自加工；磁力搅拌器：78-1 型， 国华电器有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 酶解反应
将新鲜猪皮刮脂、洗净、缴碎，测定干基含量（105 ℃下干燥至恒重）。称取一定量上述原料加入发酵罐 （置于磁力搅拌器上），按照设计的底物浓度向发酵罐 中补适量自来水（扣除原料带水量）。连接发酵罐和超 级恒温水浴，然后启动磁力搅拌器和超级恒温水浴， 将料液加热到 90～95℃下保持 5min。降温至酶解温 度后，在发酵罐上安装 pH 计电极，然后在搅拌下以一 定方式加入蛋白酶进行水解，在反应过程中不断进行 搅拌，并滴加 2mol/LNaOH 维持 pH 值不变。水解结束 后，水解液经过高温灭活（95℃下加热 5min），在 4000 r/min 的条件下离心 10 分钟，取适量上清夜供分析用， 同时小心取出全部残渣经充分干燥后用于测定降解率 （HR 定义为：（底物投料量－剩余参渣量）／底物投 料量）。
[4] Alder-Nissen J. Enzyme Hydrolysis of Food Protein[M] London: Elsevier 1986.427
K2 248.5 29.4 251.3 29.2 263.9 27.6 247.4 28.4
K3 248 26.1 248.1 26.6 271.9 34.9 247.4 26.7
13
表 3。
92
降解率/% 水解度/%
表 1 正交试验试方案
88
因素
降解率
12
水
平
A 温度
C 酶与底物比 D 底物浓 B pH
(℃)
(E/S)
度(g/L)
84 80
水解度
1
55
7.5
5
40
2
60
8
12.5
60
3
65
8.5
25
80
76
11
0
2
4
6
时 间／h
实验号 A
1
1
2
1பைடு நூலகம்
3
1
4
2
5
2
6
2
表 2 正交试验结果
k1 83.5 9.3 82.5 9.2 70.4 6.9 84.1 9.4
k2 82.8 9.8 83.8 9.7 88.0 9.2 82.5 9.5
k3 82.7 8.7 82.7 8.9 90.6 11.6 82.5 8.9
R 0.8 1.1 1.3 0.8 20.2 4.7 1.6 0.6
A1 A2 B2 B2 C3 C3 D1 D2