酵母细胞表面展示

精选ppt
5
最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达
凝集素展示表达
是将外源基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列(含GPI锚 定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游,融合蛋白 诱导表达后,信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌, 由于融 合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列 ,可 将蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将蛋白分子展示表达在 酵母细胞表面。
随之发展起来的基于靶点的药物筛选至今已有大量成 功先例。
选择的靶点基本上可分为四种类型： 离子通道、核受体、G 蛋白偶联受体(GPCRs)和酶。
精选ppt
18
离子通道
直接活性筛选 可通过酵母系统直接进行化合物活性筛选，这主要源于两种情况: (1)在离子转运缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生补充 生长的表型； (2)在酵母中表达离子通道蛋白可导致酵母生长缺陷。 在筛选离子通道抑制剂时，前种情况可筛选那些导致酵母生长 受抑的化合物，而后种情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长 的化合物。
大
融合蛋白 分子数量
多
精选ppt
10
酵母表面展示系统的应用
酒精发酵
酵母表面展示
生物吸附 高通量筛选
精选ppt
11
乙醇发酵
为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步 进行，莫春玲等通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将 来自丝状真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤 维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的 β-葡糖 苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达 3 种纤维素酶的酵母菌群 系统。
酵母细胞表面展示技术及其在高通 量筛选中的应用
精选ppt
1
目录
• 酵母细胞表面展示技术的概述 • 酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用
精选ppt
2
酵母细胞表面展示技术的概述
酵母细胞表面展示技术概念 酵母细胞表面展示技术基本原理 酵母细胞表面展示技术常见系统 酵母细胞表面展示技术的特点
精选ppt
酵母细胞表面展示技术在高通量筛选 中的应用
1
高通量筛选的概念
2
高通量筛选的技术过程
3 酵母细胞展示在HTS中的主要应用
精选ppt
14
高通量筛选（HTS）又称大规
模集群式筛选，是由高容量化合 物库、自动化操作、高灵敏度检 测、高特异筛选模型、高效率数 据处理5个子系统有机组合而成， 是一种新型的筛选技术。
精选ppt
19
Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、 质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道 蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母 恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个 流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法 进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离 子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设 计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假 阳性的剔除提供了一个快速的二次检验方法。
精选ppt
6
凝集素系统又分为α-凝集素(Agα)系统和a-凝集素(Aga) 系统
在α-凝集素系统中，α凝集
素的 C 端可锚定在酵母细胞壁 的葡聚糖上，外源蛋白作为N端 与α凝集素C端融合，在信号肽 引导下分泌表达，从而实现了外
源蛋白的展示表达。
a-凝集素是 Agalp 和Aga2p亚单 位通过二硫桥相连，其中 Agalp 通过β-葡聚糖共价连接在细胞 壁上，目的蛋白与Aga2p的N端融 合表达后，再通过Agalp与酵母
即使如此，利用酵母表面展示技术表达纤维素酶的新型酵母菌群 进行纤维素乙醇发酵效果还不是很理想，乙醇产率较低，难以满足 实际生产需求。
该系统已经得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多亟待解
决的问题，例如：展示在细胞表面的纤维素酶的活性与游离酶相
比有所下降；成功展示的纤维素酶稳定性有待提高。
精选ppt
13
精选ppt
15
高通量筛选的技术过程
• 1、样品库 • 2、初筛和复筛 • 3、活性化合物 • 4、深入筛选 • 5、获得少量先导化合物 • 6、确证筛选药物药理学研究 • 7、侯选药物 • 8、临床前研究
精选ppt
16
酵母展示在高 通量筛选中的
应用
精选ppt
17
药物筛选
把酵母应用于药物筛选，最早始于利用酵母双杂交技 术来确定药物靶点。
• 絮凝结构域锚定系统是利用 FLo1p的中间絮凝功能结构 域与外源蛋白融合，通过絮 凝功能结构域识别酵母细胞 壁中的甘露聚糖链并非共价 作用诱导细胞粘附、聚集成 可逆性絮状物。
精选ppt
8
精选ppt
9
酵母表面展示技术的特点
特点
表达偏差 小
筛选、纯 化、活性 测定方便
融合蛋白 相对分子 质量范围
细胞壁的共价连接而展示在细胞
表面。
精选ppt
7
絮凝素展示表达
絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将 融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚FLo1p的 C -末端含有的GPI 信号锚定外源蛋白,此系统
与凝集素展示相似。
3
酵母细胞表面展示技术的概述
• 酵母细胞表面展示技术(Surface Display)是一种真核蛋白表达系统。
它是一类筛选蛋白质突变体库的高通量 筛选方法，在抗体蛋白的研究中应用尤 其广泛，具有高效、灵敏等特点，在医 药、食品、生物燃料等多个工业领域都 有广泛的应用前景。
精选ppt
4
• 基本原理：是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列 融合后导入酵母细胞，用酵母细胞内蛋白转运机制将目 的蛋白转移至细胞表面并且固定在细胞膜上。与其它表 面展示系统相比,酵母表面展示系统可克服真核蛋白在原 核细胞表达时活性降低或失活的缺点。
经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位，酶活测定，乙醇发酵性 能验证，结果表明：展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能 活性；
精选ppt
12
在EGII、CBHII和BGLI协同作用下重组酵母菌株能够水解溶胀磷 酸纤维素 (Phosphoric acid swollen cellulose，简称 PASC)并产生 乙醇，乙醇浓度达到最大值0.77 g/L，乙醇产量为 0.35 g/L，相当 于理论值的68.6%。