如何选择色谱柱

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C18简介

C18是连接了18烷基碳链的反相固定相的总称.ODS 是以硅胶为基质键合的C18填料, 而C18还包括其他基质的填料,比如高聚物小球为基质,氧化铝为基质,氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相,这些可以称为"C18",但是不是ODS.

2)RP-18也是C18中的一种,不同的公司对C18填料有不同的商业名称,本质应该都是一样的.Merck公司的填料喜欢叫RP-18. 比如Merck 的LiChrospher RP-18, Superspher RP-18,Purospher RP-18. 因此,我认为说"RP-18"是改进型的不妥当.Merck的改进表现在前边的名字上,比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表现的是不同的性能.

3) "普通ODS分析酸性、中性或弱碱性化合物时均可以获得较佳的峰不对称度。但当分析药物化合物中的强极性含氮的碱性样品时,样品峰形就极差,拖尾严重,定量分析精度下降",这句话我认为值得商榷.普通的ODS,在分离中性化合物,极弱性的酸或硷化合物的时候可以得到较好的峰形,对于弱至中等极性的酸碱化合物,多数情况下会出现不同程度的拖尾.对于强极性化合物,不单是药物,其他化合物一样,都会出现严重的拖尾现象.

ODS 对强极性分离不行。

C8 和C18都是反相色谱柱的一种,适用于分析弱极性的物质,而C8在弱极性较强的一侧,C18在极性较弱的一侧。也就是说,C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质,C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的差别,但是差别并不是特别明

显,一般能用C8分析的物质,在C18上也能分离。这是因为,后者比前者的保留特性更好一些,这似乎和色谱柱填料的结构关系更为密切。

在让我们谈谈空间位阻的问题,也许由于C18比C8的碳链更长,因此带来更好的保留特性。因此C8就更适合分析大分子类的物质,比如一些球蛋白等,都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反,分子量较小的物质,经常用C18来进行分析和分离。

另外,你还会经常在C18前面看到“ODS”的字样,ODS是英文octadecyl silane的所写,意思是十八(烷)基硅烷,是以硅胶为基质键合的C18填料,由于大部分的C18柱都是硅胶基质,因此有时你还会看到色谱柱上只标称二者之一。其中以ODS居多。有时你还会看到ODS-x,x是不同的数字,这个x虽然是数字,但是不同厂家的产品代表的含义不同,一般以含碳量区分,但这也不是绝对的。有时还可能看到RP-18或RP-8,RP-18和C18意义基本一致,但是不同的厂家有不同的规定。

C8和C18虽然有这些差别,但是使用和维护的办法都是一样的。采用反相色谱柱的维护办法就可以了。

怎样选择高效液相色谱柱

现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料

的选择中。但是色谱填料的选责范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解。如何选择高效液相色谱柱:

一、硅胶基质填料

1,正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团

(ZH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性教强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强落的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯(Chloroform) 二氯甲烷(Methylence Chloride)等.

2反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对教弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性教强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性教强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有C18(ODS) C8(MOS)。C4(B)C6H5(Phenyl)等。二、聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等,其主要优

点是在PG值为1-14均可使用。

相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的淑水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。

现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效教低。

三、其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,新型氧化诰填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化诰微球色谱柱,应用PH范围1~14,温度可达到1000C。由于氧化诰填料几年才开始研究,加之前的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中。

四、怎样选择填料粒度

目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3,5和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的

填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是唯一的因素。如果固定相选择是真确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很用有的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5UM 填料的柱效提高近30%;然而;3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。

五、如何保证良好的柱性能与柱寿命

üü认证阅读色谱柱使用说明书

üü使用填充良好的色谱柱;

üü尽量减少压力波动,避免机械及热冲击

üü使用保护柱及在线过滤器

üü经常以强溶剂冲洗色谱柱

üü充分过滤样品及流动相,尽量避免杂质微粒与保强留分成

üü用稳定的固定相(C18最稳定)

üü在中等PH纸操作(6~8),用有机年成液溶;

üü色谱柱使用温度最好小于400C

üü硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0

üü在水流动相与缓冲浓液中加200ppm的叠氮钠

üü流动相中含有缓冲溶液,应注意应95∶5的水及有

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