毒理学实验指导

《食品毒理学》实验指导

实验一半衰期的测定-比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

实验二兔血液红细胞计数

实验三四氯化碳对家兔肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的影响实验

*所需实验仪器：电子天平、水浴锅、pH计（试纸）、显微镜、分光光度计、离心机、一次性注射器。

实验一半衰期的测定-比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

一、原理、目的

药物血浆半衰期t1/2即血浆药物浓度下降一半所需的时间。绝大多数药物是按一级动力学规律消除（恒比消除），因此每种药物都有固定的t1/2，不因血浆浓度高低而改变。本实验用分光光度法测定水杨酸钠的血浆浓度并计算t1/2。水杨酸钠为抗炎药，经肝代谢，在酸性环境中与三氯化铁生成一种紫色的络合物，在520nm波长下比色，其光密度与水杨酸浓度成正比。

通过测定水杨酸钠的血浆半衰期，使学生了解水杨酸钠在体内的消除速度，并掌握其血浆半衰期的测定方法。半衰期是判断毒物蓄积程度的重要参数，对中毒和解毒有一定的实践意义。

二、试剂、器材及动物

离心管、试管、磅秤、玻璃棒、注射器、吸管、离心机、721型分光光度计；三氯醋酸、水杨酸钠、三氯化铁；兔。

三、方法步骤

1、取离心管和试管各5支，分别标为1~5号，备用。5支离心管各加入10％三氯醋酸7ml。

2、取兔1只，称体重，从耳静脉取血2ml置入1号离心管，用玻璃棒搅拌。然而自耳静脉注入10%水杨酸钠(剂量为150mg/kg)，并立即和60min后两次自另一耳静脉取血2ml，分别注入2、3号离心管中，搅拌。4、5号离心管分别加入蒸馏水和0.02%水杨酸钠2ml。

3、取上述5支离心管进行离心(2 000r/min，5min)，准确吸取上清液6ml放入编号相对应的试管中，分别滴入10%三氯化铁12滴(0.6m1)摇匀5min后比色。

4、用721型分光光度计520nm波长比色，以4号管调“0”，读得5号管光密度为x，再以1号管调“0”，读得2号管为x1，3号管为x2，将上述操作归纳为下表：

水杨酸钠血浆半衰期的测定

试管名编号三氯醋酸

（ml）

兔血

（ml）

0.02%水杨酸钠

（ml）

蒸馏水

（ml）

离心上清液

（ml）

三氯化铁

（gtt）

对照 1 7 2 —— 6 12 立即 2 7 2 —— 6 12 60min 3 7 2 —— 6 12 空白 4 7 —— 2 6 12 标准 5 7 — 2 — 6 12

5、计算半衰期

①求k值：k=y/x; y=0.02

②求水杨酸钠血浓度：给药后立即血浓度y1=kx l；给药后60min血浓度y2=kx2 。

③根据下列公式求半衰期：

t1/2 =

四、结果

结果测定

5号管光密度（x）2号管光密度（x1）3号管光密度（x2）t1/2

实验二血液红细胞、白细胞计数

A【红细胞计数】

红细胞计数（red blood cell count，RBC）是指计算每升血液内所含红细胞的数目。红细胞计数的方法有显微镜计数法、血沉管计数法、光电比色法、血细胞电子计数器计数法等。目前在临床上使用最广泛的是显微镜计数法（计数板法）。

一、原理

血液经稀释后，充入血细胞计数板，用显微镜观察，计数一定容积内的红细胞数并换算成每μl 内的数目。

二、器材

1、改良式血细胞计数板：临床上最常用的是改良纽巴（Neubauer）氏计数板，它是由一块特制的玻璃板构成，玻璃板中间有横沟将其分为三个狭窄的平台，两边的平台较中间的平台高0.1mm。中央平台又有一纵沟相隔，其上各刻有一个计数室。每个计数室划分为9个大方格，每一大方格面积为1.0mm2，深度为0.1mm；四角每一大方格划分为16个中方格，为计数白细胞用。中央一大方格用双线划分为25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计400个小方格，此为红细胞计数之用。

2、血盖片：专用于计数板的盖

玻片呈长方形，厚度为0.4mm。

3、沙利氏（shali）吸血管或红

细胞稀释管，5ml吸管、中试管。

4、显微镜，计数器等。

5、稀释液：0.85％氯化钠溶液。

三、方法

试管稀释法

用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml（或4ml亦可）置于试管中。用沙利氏吸血管吸取全血样品至20μl刻度处（或吸血至刻度10处，红细胞稀释液用2ml）。擦去吸管外壁多余的血液，将此血液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内粘附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数

次，再用毛细吸管（或玻棒）吸取已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，即可自然流入计数室中。注意充液不可过多或过少，过多则溢出而流入两侧槽内，过少则计数池中形成气泡，致使无法计数。

计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然后转用高倍镜。在此中央大方格内选择四角与最中的五个中方格（或用对角线的方法数五个中方格），每个中方格有16个小方格，所以共计数80个小方格。计数时注意压在左边双线上的红细胞计在内，压在右边双线上的红细胞则不计数在内；同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此所谓“数左不数右，数上不数下”的计数法则。

四、计算

R/80×400×200×10=1mm3血液中红细胞个数。

R — 5个中方格（即80个小方格）内的红细胞总数。

400 —一个大方格，即1mm2面积内共有400个小方格。

200 —稀释倍数。

10 —血盖片与计数板的实际高度是1/10mm，乘10后则为1.0mm。

上式简化后为R×10，000=红细胞数/mm3

推算后即：每升血液中的红细胞数M=R×1010 (200倍稀释)

五、注意事项

（1）红细胞计数是一项细致的工作，稍有粗心大意，就会引起计数不准。关键是防凝、防溶、取样正确。取抗凝血时，抗凝剂的量要合适，不可过少使血液部分呈小块凝集；采血时应注意及时将抗凝剂与血液混匀。防溶是指防止过分振摇而使红细胞溶解，或是器材用水洗后未用生理盐水冲洗而发生溶血，使计数结果偏低。取样正确是指吸血10或20μl一定要准确，吸血管外的血液要擦去，吸血管内的血液要全部洗入稀释液中，稀释液的用量要准；充液量不可过多或过少，过多可使血盖片浮起，过少则计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。此外，显微镜台未保持水平，使计数室内的液体流向一侧，这些操作上的错误均可使计数结果不准确。

（2）器材清洗方法：沙利氏吸血管或试管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后用蒸馏水、酒精、乙醚，按次序分别吸吹数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸馏水冲洗后，用绒布轻轻擦干即可，切不可用粗布擦试，也不可用酒精、乙醚等溶液冲洗。

六、参考值

家兔：(5.87±0.32)×1012/L；

成人男性：(4.0-5.5)×1012/L；成人女性：(3.5－5.0)×1012/L