超氧化物歧化酶(SOD)过氧化物酶(CAT)苯丙氨酸解氨酶(PAL)实验测定方法总结

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法

依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。

表2 NBT法测定SOD酶活性

50mM pH 7.8磷酸缓冲液（mL）130mM

甲硫氨

酸溶液

（mL）

750μM

氮蓝四

唑溶液

（mL）

100μM

EDTA-Na

2

（mL）

蒸馏

水

（mL）

酶粗提

液（mL）

20μM

核黄素

溶液

（mL）

1 3.

2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.6

2 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.6

3 3.18 0.6 0.6 0.6 0.

4 0.02 0.6

4 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6

5 3.18 0.

6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6

6 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6

注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管

各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10 min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位

SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack*0.1*C)

式中：C-蛋白含量（mg）

Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度

Ae-样品管吸光度

试剂配制方法：

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa

2HPO

4

（1.638582g）

+8.5ml0.05M NaH

2PO

4

(0.06630425g)

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/L EDTA-Na

2溶液：称取0.03721g EDTA-Na

2

，用磷酸缓冲液定

容至1000ml。（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。

过氧化物酶（CAT）活性测定----紫外吸收法

取6只试管，其中两个为对照管，依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表3加入试剂。

表3紫外分光发测定CAT酶活性

0.2M pH7.8磷酸缓冲液（mL）蒸馏水

（mL）

酶粗提液

（mL）

1（对照） 1.7 1 0

2 1.5 1 0.2

3 1.5 1 0.2

4 1.

5 1 0.2

5 1.5 1 0.2

25℃预热后，逐管加入0.6mL 0.1M的H

2O

2

。每加完一管立即计时，并迅速

倒入石英比色皿中，在260nm下测定吸光度，每隔2 min读数一次，共测12min,待4个管全部测完。记录数据，计算活性。以1min内A240减少0.01的酶量为1个酶活单位（u）

CAT活性计算公式(U/g.Pr/min)= △A240/(C*0.01*t)

式中：△A240 = A240(ti)—A240(tt)

C—蛋白含量

0.01—A240每下降0.01为1个酶活单位（u）；

t—加过氧化氢到最后一次读数间的时间（min）。

试剂配制方法：

（1）0.2M pH7.8磷酸缓冲液：0.2mol/L Na

2HPO

4

91.5ml(6.553962g)+0.2mol/L NaH

2PO

4

8.5ml(0.265217g)

(2) 0.1M H

2O

2

：（30%的H

2

O

2

溶液5.68mL稀释至1000Ml）

SOD同工酶研究

取200 uL酶粗提液，按照1：1（v/v）的比例和样品溶解液混合，室温放置15-30 min。装置好垂直电泳制胶器，然后按照表4做分离胶。先倒入分离胶，大约倒到距离梳子有1cm停止，加入蒸馏水对分离胶进行水封，使胶面平整。待凝固。

表4分离胶12%

蒸馏水（mL）分离胶缓冲

液（mL）30%Acr-Bis

（mL）

TEMED（uL）10%APS

（uL）

取量 3.45 2.5 4.0 20 70

等分离胶完全凝固后，吸出蒸馏水，把按照表5配制好的浓缩胶倒入两板之间，直至凹板约0.5cm处停止，插入梳子，待凝固。

表5浓缩胶4%

蒸馏水（mL）浓缩胶缓冲

液（mL）30%Acr-Bis

（mL）

TEMED（uL）10% APS

（uL）

取量 6.2 2.5 1.33 20 70

等浓缩胶完全凝固后，缓慢拔出梳子，把电泳装置放入电泳槽，加入5×电极缓冲液，使液面高出凹板少许。按照测定的蛋白含量确定各个葡萄样本的点样量。点完样，通电电泳。在浓缩胶中以20 mA的电流进行电泳，等进入分离胶后，调节电流至45 mA，直至颜色样量距离胶板边缘1cm处停止。取下胶板，放入培养皿中，倒入一定量的显色液，在4℃、黑暗条件下放置30 min，并不断摇匀，之后在4℃、光照条件下，摇动，直至蛋白条带显出。

试剂配制方法：

（1）30%Acr-Bis：29.2g Acr + 0.8g Bis 加蒸馏水至100mL 棕色瓶4℃保存

（2）分离胶缓冲液： 18.15g Tris 加50mL蒸馏水 HCl调pH至8.8 加蒸馏水至100mL 4℃保存

（3）浓缩胶缓冲液：6g Tris加50mL蒸馏水 HCl调pH至6.8 加蒸馏水至100mL 4℃保存

（4）10% APS：过硫酸铵（APS）1g溶于10mL蒸馏水中

（5）样品溶解液：浓缩胶缓冲液（1.0mL）甘油（0.8 mL ）α-巯基乙醇（0.4 mL）0.1%（w/v）溴酚兰（0.4 mL）蒸馏水（5.4 mL）4℃保存（6）电极缓冲液pH8.3：Tris 15g + Glycine(甘氨酸) 72g 加水至1L 4℃保存

（7）2.45mmol/L NBT母液:0.02003gNBT溶于10ml蒸馏水中避光保存（8）0.3mmol/L 核黄素母液：0.0056454g核黄素溶于50mL蒸馏水中避光保存

（9）显色液：2.45mmol/L NBT母液（5mL）0.3mmol/L 核黄素母液（5 mL）TEMED（167uL）EDTA-Na2(0.037224g) 加蒸馏水至50 mL 避光保存