基因的体外转录和翻译
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2015年5月28日星期四 18
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液 中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与 蛋白质浓度成正比。
2015年5月28日星期四 22
收集细胞核：沉淀用细胞分离液洗1次， 550g离心8min，收集细胞核沉淀。 裂解细胞核：取沉淀重悬于原体积 1/100的细胞核裂解液中，搅拌30min， 100000g离心30min。
2015年5月28日星期四
23
核提取物的浓缩：测上清体积，按1ml 上清液加入0.33g硫酸铵粉末。 5~10min内缓慢加入并搅拌30min。 100000g离心15min沉淀蛋白。沉淀物 溶于1/200原体积的透析缓冲液，4℃
2015年5月28日星期四
34
常用的翻译系统的制备：
1、细胞裂解物的制备
(1)收集一定数量生长良好的细胞， 于10ml培养液中，1500rpm离心5min。 得细胞沉淀，用0.01mol/L PBS漂洗2 次；
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35
(2)用10倍细胞体积的预冷缓冲液裂 解细胞
(1%Triton X100，150mmol/LNaCl， 10mmol/LTris.HCl pH7.4，1mmol/LEDTA， 1mmol/L EGTA，pH8.0 0.2mmol/LPMSF，0.5％ NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF： 苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯－40 醚）；
2015年5月28日星期四 31
基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因 转录产物RNA为模板，在核糖体上 进一步生产蛋白质的过程。 基因体外翻译的模板： 1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后 的RNA。
2015年5月28日星期四 32
2015年5月28日星期四 8
基因体外转录体系 DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
2015年5月28日星期四
9
细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
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体外基因转录反应 体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑 料管，在24~32℃条件下迚行，为 了保证产物的稳定，反应体系中必 须加入RNase抑制剂，终止反应时， 可加入蛋白酶以降解核提取物中的 RNase。同时加入酵母tRNA作为产 物RNA的载体起到保护作用。反应 体系中以四种核苷酸为底物，其中 一种是被标记的。
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30
体外翻译的实验方法主要用于： 1、基因产物的快速确定； 2、基因突变体的快速和分析； 3、蛋白质活性研究； 4、众多基因产物的同时表达； 5、大分子间的相互作用； 6、影响翻译过程的物质检出； 7、表达对细胞有毒性的蛋白和易 于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形 成不溶包含物的蛋白。
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5
基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用； 5、染色质结构调整与基因转录的关系； 6、制备RNA探针。
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。 (5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
2015年5月28日星期四
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3
基因体外转录和翻译的作用：为研 究基因转录和蛋白质翻译提供了一 个十分理想实验体系和技术平台及 找到了一个研究与探讨转录和翻译 这两个复杂的现象的重要手段和方 法。
2015年5月28日星期四
4
第一节 基因的体外转录
• 一、基因体外转录的目的和意义 • 基因的体外转录体系最早由Pelham和 Jakson于1976年创立的，经很多实验室的 不断修订和改进，现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术，已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
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1
什么是基因的体外转录和翻译 基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
2015年5月28日星期四
2
基因表达包括：转录和翻译两个过 程。 基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
14
附：Bradford法测蛋白含量
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法（Bradford法），是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点，因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。
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2015年5月28日星期四 16
Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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17
（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严栺地控制时间。
2、精胺－亚精胺混合物改迚法 优点：分离到的细胞核比较纯净 缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
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过程： 收集细胞：收集一定数量的培养细 胞，300g离心5min，沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴 10min后，匀浆，镜检，至90%细 胞破碎，细胞核游离出来为止， 550g离心8min。
1、一般方法
优点：细胞核完整、内含物丰富
缺点：在分离的细胞核中可能存 在少量细胞质成分
2015年5月28日星期四 10
(1)收集细胞：取5×106/ml的培养细胞 20ml，1500rpm离心5min，用新配制的 0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收 集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓 冲液[0.01mmol/ L HEPES(4－羟基乙基哌 嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl， 1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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(3)裂解液4℃下搅动5min，16000g 离心15min后，上清液即为细胞裂解 物。 细胞的主要来源：酵母细胞、麦芽 组织细胞、兔网织红细胞和Hela细 胞。
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37
2、细胞核糖体的分离： (1)收集一定数量的成纤维细胞，迅 速放于冰上，4℃ 600g离心10min， 收集细胞沉淀，用预冷的TBS悬浮 细胞并洗涤3次。 (2)用2倍体积的TBSM(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/L KCl和1.5mmol/L乙酸镁)悬浮最后的 细胞沉淀，0 ℃放置5min，在匀浆 器中匀浆10~20次。
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(3)每0.9ml匀浆液加0.1ml浓缩的 10*TBS-M缓冲液，混合，4 ℃ 10000g 离心10min。 (4)收集上清提取物，在提取物中加入 ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各种 氨基酸。 (5) 37℃培养45min。 (6) 室温下10000g离心混合物10min，冷 却上清，在4℃ 条件下进行SephadexG25柱层析。收集260nm吸收峰，4 ℃ 165000g离心90min 。
透析4~5h。
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wk.baidu.com
核提取物的保存：高速离心10min。去 除不溶物，测定蛋白浓度，用预冷的 小管分装。提取物可在液氮中冻存， －80℃可保存数月。如有沉淀，可高 速离心10min，去除不溶物。 制备细胞核提取物时应注意： 1、含有细胞核中的所有可溶性蛋白。 2、得到的蛋白质具有转录活性。 3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋 白的流失。
利用不同模板和翻译体系进行翻译 时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的 3ˊ未端含有合适的终止信号。
2015年5月28日星期四
33
基因体外翻译的基本实验流程 体外翻译系统的制备：该系统为基 因体外翻译提供必要的条件。 1、核糖体：是蛋白质合成的装配 机； 2、环境条件：如离子、翻译过程 中所需的各种因子等。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律迚行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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2015年5月28日星期四 6
一、基因体外转录的基本原理 基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。 质粒DNA 模 板 线性DNA 核小体形式存在的DNA
2015年5月28日星期四 7
能用于体外转录的质粒载体 转录的必要条件：无论是真核细胞 的转录体系还是原核细胞的转录体 系，基因转录时都必须有启动子序 列，且该序列能被转录体系识别。 原核细胞体外转录体系常用的启动 子有T3、T7及SP6启动子。 真核细胞体外转录体系除需启动子， 增强子等顺式作用元件外，还需各 种反式作用元件的参与。
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体外转录所用的酶及体系
用提纯的RNA聚合酶进行体外转录 用细胞核提取物进行体外转录 用RNA聚合酶III进行体外转录
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27
体外基因转录产物的分析：基因体外 转录时，在反应体系中加入放射性标 记的底物。反应后快速提取产物RNA， 乙醇沉淀、凝胶电泳后放射自显影分 析产物。或生物素标记然后用亲和素 －辣根过氧化物酶显色系统检测。
2015年5月28日星期四 11
2015年5月28日星期四
12
(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加 入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L HEPES，pH 7.9，25％甘油， 1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L KCl， 0.2mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF， 0.5mmol/L DTT)，冰浴10min，用玻 璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀 体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌 30min。
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28
体外转录方法的选择 体外转录的方法有 用不同RNA聚合酶的基因转录体系 原核转录体系 真核转录体系 使用不同DNA模板的转录体系 细胞核抽提物的转录体系
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第二节 基因的体外翻译 基因体外翻译的目的和意义 基因的体外翻译是将基因转录产物 RNA在离体条件下直接合成蛋白质 的过程。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液 中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与 蛋白质浓度成正比。
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收集细胞核：沉淀用细胞分离液洗1次， 550g离心8min，收集细胞核沉淀。 裂解细胞核：取沉淀重悬于原体积 1/100的细胞核裂解液中，搅拌30min， 100000g离心30min。
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核提取物的浓缩：测上清体积，按1ml 上清液加入0.33g硫酸铵粉末。 5~10min内缓慢加入并搅拌30min。 100000g离心15min沉淀蛋白。沉淀物 溶于1/200原体积的透析缓冲液，4℃
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常用的翻译系统的制备：
1、细胞裂解物的制备
(1)收集一定数量生长良好的细胞， 于10ml培养液中，1500rpm离心5min。 得细胞沉淀，用0.01mol/L PBS漂洗2 次；
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(2)用10倍细胞体积的预冷缓冲液裂 解细胞
(1%Triton X100，150mmol/LNaCl， 10mmol/LTris.HCl pH7.4，1mmol/LEDTA， 1mmol/L EGTA，pH8.0 0.2mmol/LPMSF，0.5％ NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF： 苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯－40 醚）；
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基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因 转录产物RNA为模板，在核糖体上 进一步生产蛋白质的过程。 基因体外翻译的模板： 1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后 的RNA。
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基因体外转录体系 DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
2015年5月28日星期四 25
体外基因转录反应 体外基因转录一般用硅化的1.5ml塑 料管，在24~32℃条件下迚行，为 了保证产物的稳定，反应体系中必 须加入RNase抑制剂，终止反应时， 可加入蛋白酶以降解核提取物中的 RNase。同时加入酵母tRNA作为产 物RNA的载体起到保护作用。反应 体系中以四种核苷酸为底物，其中 一种是被标记的。
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体外翻译的实验方法主要用于： 1、基因产物的快速确定； 2、基因突变体的快速和分析； 3、蛋白质活性研究； 4、众多基因产物的同时表达； 5、大分子间的相互作用； 6、影响翻译过程的物质检出； 7、表达对细胞有毒性的蛋白和易 于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形 成不溶包含物的蛋白。
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基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用； 5、染色质结构调整与基因转录的关系； 6、制备RNA探针。
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。 (5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
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基因体外转录和翻译的作用：为研 究基因转录和蛋白质翻译提供了一 个十分理想实验体系和技术平台及 找到了一个研究与探讨转录和翻译 这两个复杂的现象的重要手段和方 法。
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第一节 基因的体外转录
• 一、基因体外转录的目的和意义 • 基因的体外转录体系最早由Pelham和 Jakson于1976年创立的，经很多实验室的 不断修订和改进，现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术，已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
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什么是基因的体外转录和翻译 基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
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基因表达包括：转录和翻译两个过 程。 基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
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附：Bradford法测蛋白含量
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法（Bradford法），是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点，因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。
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Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严栺地控制时间。
2、精胺－亚精胺混合物改迚法 优点：分离到的细胞核比较纯净 缺点：分离过程中一些特殊的试剂 破坏了细胞核膜，造成核内容物的 部分流失及操作过程中精胺易使 DNA模板产生沉淀
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过程： 收集细胞：收集一定数量的培养细 胞，300g离心5min，沉淀用分离 液清洗2次。 裂解细胞纯化细胞核：沉淀中加入 预冷的匀浆液1/10(原体积)，冰浴 10min后，匀浆，镜检，至90%细 胞破碎，细胞核游离出来为止， 550g离心8min。
1、一般方法
优点：细胞核完整、内含物丰富
缺点：在分离的细胞核中可能存 在少量细胞质成分
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(1)收集细胞：取5×106/ml的培养细胞 20ml，1500rpm离心5min，用新配制的 0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收 集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓 冲液[0.01mmol/ L HEPES(4－羟基乙基哌 嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl， 1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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(3)裂解液4℃下搅动5min，16000g 离心15min后，上清液即为细胞裂解 物。 细胞的主要来源：酵母细胞、麦芽 组织细胞、兔网织红细胞和Hela细 胞。
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2、细胞核糖体的分离： (1)收集一定数量的成纤维细胞，迅 速放于冰上，4℃ 600g离心10min， 收集细胞沉淀，用预冷的TBS悬浮 细胞并洗涤3次。 (2)用2倍体积的TBSM(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/L KCl和1.5mmol/L乙酸镁)悬浮最后的 细胞沉淀，0 ℃放置5min，在匀浆 器中匀浆10~20次。
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(3)每0.9ml匀浆液加0.1ml浓缩的 10*TBS-M缓冲液，混合，4 ℃ 10000g 离心10min。 (4)收集上清提取物，在提取物中加入 ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各种 氨基酸。 (5) 37℃培养45min。 (6) 室温下10000g离心混合物10min，冷 却上清，在4℃ 条件下进行SephadexG25柱层析。收集260nm吸收峰，4 ℃ 165000g离心90min 。
透析4~5h。
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核提取物的保存：高速离心10min。去 除不溶物，测定蛋白浓度，用预冷的 小管分装。提取物可在液氮中冻存， －80℃可保存数月。如有沉淀，可高 速离心10min，去除不溶物。 制备细胞核提取物时应注意： 1、含有细胞核中的所有可溶性蛋白。 2、得到的蛋白质具有转录活性。 3、分离得到的细胞核比较纯且没有核蛋 白的流失。
利用不同模板和翻译体系进行翻译 时，应匹配相应的翻译起始序列。 如用原核细胞翻译体系时RNA模板 应含有SD序列，应用真核翻译体 系时，应有帽子结构；在RNA的 3ˊ未端含有合适的终止信号。
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基因体外翻译的基本实验流程 体外翻译系统的制备：该系统为基 因体外翻译提供必要的条件。 1、核糖体：是蛋白质合成的装配 机； 2、环境条件：如离子、翻译过程 中所需的各种因子等。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律迚行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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一、基因体外转录的基本原理 基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。 质粒DNA 模 板 线性DNA 核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体 转录的必要条件：无论是真核细胞 的转录体系还是原核细胞的转录体 系，基因转录时都必须有启动子序 列，且该序列能被转录体系识别。 原核细胞体外转录体系常用的启动 子有T3、T7及SP6启动子。 真核细胞体外转录体系除需启动子， 增强子等顺式作用元件外，还需各 种反式作用元件的参与。
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体外转录所用的酶及体系
用提纯的RNA聚合酶进行体外转录 用细胞核提取物进行体外转录 用RNA聚合酶III进行体外转录
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体外基因转录产物的分析：基因体外 转录时，在反应体系中加入放射性标 记的底物。反应后快速提取产物RNA， 乙醇沉淀、凝胶电泳后放射自显影分 析产物。或生物素标记然后用亲和素 －辣根过氧化物酶显色系统检测。
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(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加 入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L HEPES，pH 7.9，25％甘油， 1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L KCl， 0.2mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF， 0.5mmol/L DTT)，冰浴10min，用玻 璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀 体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌 30min。
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体外转录方法的选择 体外转录的方法有 用不同RNA聚合酶的基因转录体系 原核转录体系 真核转录体系 使用不同DNA模板的转录体系 细胞核抽提物的转录体系
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第二节 基因的体外翻译 基因体外翻译的目的和意义 基因的体外翻译是将基因转录产物 RNA在离体条件下直接合成蛋白质 的过程。