第三章 酶的发酵生产

五、温度的调节控制
1、温度对酶的发酵生产的影响
在发酵初期，细胞吸收营养物质合成自身物质和酶， 吸热反应，培养基中的营养物质被大量分解释放热 反应，但此时吸热反应大于放热反应，培养基需升 温；
当细胞繁殖迅速时，情况相反，需降温维持细胞生 产繁殖和产酶所需的最适的温度。
细胞（微生物）生产繁殖和产酶的最适温度随菌种 和酶的性质不同而异，并且生长繁殖和产酶的最适 温度往往不一致。 一般，细菌为37℃，霉菌和放线菌为28～30℃， 一些嗜温微生物需在40～50℃生长繁殖， 如：红曲霉的生长温度为35℃～37℃，而产糖化 酶的最适温度为37 ℃～40 ℃。
1、划线分离法
将样品制备适当的稀释液，用接种环蘸取样品 稀释液在培养基平板上分区划线分离，然后培养直 至单个菌落出现。
2、稀释分离法
五、菌株产酶性能鉴定
1、平板透明水解圈法
透明圈直径与产酶的关系： lg[E] / D=k· △[C] / lgt R/r·
其中：
[E] ：产酶浓度； D：菌体量； R：水解圈； r：菌落直径；△：琼脂厚度；[C] ：底物浓度； t：培养时间； k：常数。
（一）固体培养发酵（传统的方法）
一般适合于真菌发酵。
（二）液体深层发酵：
①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵。 ②易于人为控制。 ③机械化程度高，酶产品质量好，酶产率及回收 率较高。
（三）固定化细胞发酵（70年代后期）
1、优点：重复使用、易于分离、易于机械化、 抗逆性强、效率高。 2、缺点：产品质量不够稳定、易受传质和氧 的限制。
4、滞后合成型
只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大 量积累。许多水解酶类属于此类。 它们在细胞对数期 不合成，可能是受 到分解代谢产物的 阻遏作用，当阻遏 解除后，酶开始合 成，其对应的 mRNA稳定性高。
三、影响酶生物合成的主要因素
mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在，是 影响酶生物合成模式的主要因素。 ⑴ mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继 续合成其对应的酶。
2、酶发酵生产常用的碳源：甘薯、麸皮、
玉米、米糠、土茯苓等淀粉质原料。此外也 有以石油产品中12～16碳的成分为碳源。
（二）氮源：
1、选择原则：
①根据不同的细胞要求选择； ②注意C/N 比。
2、常用的氮源：豆饼、花生饼、菜籽饼等；无
机氮：(NH4)2SO4 、 NH4Cl、 NH4NO3和 (NH4)3P高产细胞株的筛选 发酵产酶
2、特点
①产率提高
②缩短周期 ③易于管理，减轻劳动强度
④提高产品质量。
3、工艺条件及控制
⑴培养基 ⑵温度和pH ⑶通风和搅拌
⑷添加前体或中间产物
⑸添加刺激剂
植物细胞发酵产的酶有：糖苷酶、漆酶、过氧化 物酶、酸性转化酶等。
三、动物细胞发酵产酶 1、动物细胞没有细胞壁，显得十分脆弱，必 须小心地控制温度、pH值、渗透压以及 溶解氧等外界条件。
⑵微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。
⑶微生物培养基来源广泛、价格便宜。 ⑷可采用微电脑技术控制酶发酵的过程，生产可连 续化、自动化、经济效益高。 ⑸可以利用以基因工程为主得 近代分子生物技术， 选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。
二、菌种的分离纯化
①根据微生物的生态特征，从自然界中取样， 分离出所需菌种。比如土壤。 ②从发酵生产材料中进行分离，比如分离产纤 维素酶的菌种，可以从沤制的稻草或秸秆上分离。
（三）无机盐
产酶培养基常需添加一定量的无机盐， 主要有：P、S、K、Mg、Ca、Na盐等。 （四）微量元素
产酶培养基中的微量元素有：Fe、Mn Zn 、Cu 、Co（钴）、Mo（钼）等。 （五）生长因子
一般来源于玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、 酵母膏等。
四、pH值的调节
（一） pH值对细胞生长繁殖及发酵产酶的影响 ①一般来说，培养基成分中碳/氮（C/N）比高， 发酵液倾向于酸性， pH低； C/N比低，发酵 液倾向于碱性，pH高。 ②通气量大，糖、脂完全被氧化成CO2和H2O； 通气量不足，糖、脂未完全被氧化生成中间产 物有机酸，发酵液pH下降。
②液体培养法
用三角瓶装适量的液体培养基，在摇床上振荡培养 一段时间后，取发酵液测定酶活力。 通过上述方法筛选出产酶活力高的菌株作为下一 步发酵产酶的菌种。
六、菌种变异——提高菌种的产酶活力
1、物理或化学方法诱变
2、基因工程方法
七、酶的发酵生产
通过实验确定菌种产酶的最佳发酵条件，如碳源、 氮源、温度、pH 等。然后进行 小试 中试 大规模生产
第五节 动植物细胞发酵产酶
一、动植物细胞与微生物的主要差异
⑴动植物细胞比微生物细胞大得多。 ⑵动植物细胞对剪切力敏感，其中动物细胞没 有细胞壁，更为敏感。 ⑶动植物细胞生长速率与代谢速率低，生长倍 增时间和发酵时间均长。 ⑷动物细胞营养要求高，需血清或其他代用品。
二、植物细胞发酵
1、技术路线：
2、营养要求复杂，成本较高，目前主要用于 珍贵药物的生产，如胶原酶、血纤蛋白溶 酶原活性剂等。
3、动物细胞培养方法
（1）来自于血液、淋巴组织细胞、肿瘤细胞和 杂交瘤等，采用悬浮培养。
（2）存在动物复杂器官中的细胞，与其周围细 胞互相依存，即有所谓定位依存关系，用固体或半固 体培养，常用固定化组织，固定时常用吸附法或包埋 法。
2、温度调控：通过实验摸索确定措施。
六、溶解氧的控制 细胞只能利用溶解氧，调节溶解氧速率的措施：
1、调节通气量；
2、调节氧分压；
3、调节气液接触时间；
4、调节气液接触面积；
5、培养基的特性对溶氧速率有明显影响。
七、提高酶产量的其他措施 1、添加诱导物 2、控制阻遏物浓度 3、添加表面活性剂（Tween-80、Triton X100、聚乙二醇等） 4、添加其他产酶促进剂如植酸类 如：在橘青霉培养基中添加植酸钙镁，可 使5’－磷酸二酯酶产量提高10~20倍。
比如：在进行蛋白酶 产酶菌株的筛选时， 于培养基中加入一定 的酪蛋白；筛选产淀 粉酶的菌株时，在培 养基中加入可溶性淀 粉（0.5～1.0％）。 培养后，在菌落周围 的透明水解圈越大， 酶活力相对越高。
2、固体培养和液体培养法直接测定酶活力
①固体培养：
以麸皮、稻草、米糠等农副产品为营养源，加少量 水，制成固体培养基，接种，在适宜温度下，使菌 株产酶后，取少量固体发酵基质浸出液测定酶活力。
③一些生理盐（如NaNO3）的酸根被利用导致 发酵液pH上升；碳源严重不足时，细胞利用 氨基酸的碳架，留下－NH3，发酵液pH上升。
总之， pH的变化常引起细胞生长和产酶环境 的变化，对产酶带来不利的影响。
生产中常采取调控pH的方法：
①添加缓冲液维持一定的pH； ②调节通风量维持发酵液的氧化还原电位在一 定范围； ③调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比； ④当发酵液pH过高时，用糖或淀粉来调节， pH过低时，通过氮调节。
七、酶的制剂与保存
酶制剂通常有下列四种剂型：
（一）液体酶制剂
包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后， 不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成。这种酶 制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业。
（二）固体酶制剂
发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入 淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制 成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种 产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质 量。
三、富集培养
① 当样品中所需菌种含量较低时，可以控制 pH 、温度和营养成分等条件让所需微生物大量繁 殖，以利筛选；比如，要分离产淀粉酶的菌种，而 所取的土壤样品中此菌种含量低，可以向样品中加 入少量淀粉，并控制条件使此菌种大量繁殖。 ②当样品中所需菌种含量较高时，可以直接进 入分离纯化工作。
四、菌种纯化
固体酶制剂适于运输和短期保存；一般成本也不高。
（三）纯酶制剂
包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要 求较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶， 还必须除去热源。 热源属于糖蛋白，分子量在10万以上，是染菌后 细菌分泌出来的类毒素。带有这类物质的制剂注 射到体内后引起体温升高。热原耐热耐酸但不耐 碱（pH >10），对氧化剂敏感。它可用吸附、亲 和层析等方法除去。
此类酶的特点：
①其生物合成可被诱导；
②不受分解代谢物和终产物的阻遏；
③这类酶所对应的mRNA很稳定。细胞进 入平衡期后一段时间内继续用于酶的合成。
3、中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细 胞进入平衡期后，酶的合成终止。 此类酶受到终产物的阻遏，其对应的mRNA不稳定。
第三章 酶的发酵生产
第一节
概述
一、酶的发酵生产：指利用产酶细胞在适宜 的发酵工艺条件下生产酶制剂的过程。
二、产酶细胞的来源：微生物细胞、植物细 胞、动物细胞。
三、优良的产酶细胞应具备的条件
1、酶的产量高
2、容易培养和管理 3、产酶稳定性好 4、利于酶的分离纯化 5、安全可靠
四、酶的发酵生产类型
第三节 酶生物合成的模式
一、细胞生长曲线
产酶细胞在一 定条件下进行 培养。其生长 过程一般经历 四个阶段：调 整期、对数生 长期、平衡期 和衰退期。
二、酶生物合成模式
酶的生产与细胞生长存在一定的关系， 将酶生物合成模式分为：
同步合成型
延续合成型
中期合成型
滞后合成型
1、同步合成型
2、胞内酶
①细胞分离 ②细胞破碎（匀浆法、研磨、溶胞） ③细胞碎片分离（离心分离、萃取、过滤、错流过滤） ④酶液
三、酶液的脱色
发酵液色素的来源：
1、微生物代谢过程分泌的； 2、培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的。 常用脱色的方法：离子交换剂、离子交换纤维、 活性炭等吸附法。
四、发酵液的浓缩与初步提纯
（四）固定化原生质体发酵（80年代中期）
第二节 发酵工艺条件及控制
一、产酶细胞的保藏（低温） 二、细胞活化与扩大培养 1、细胞活化：使处于代谢停滞或低水平 的产酶细胞恢复正常生产代谢活力。 2、扩大培养（制备种子液）
三、培养基的配制
（一）碳源：
1、选择原则：
①营养
②对酶生物合成具有调节作用
③原料的供求和价格
第六节 酶制剂的工业制备法
一、发酵液的预处理
加热、调节pH 、絮凝剂等措施改变发酵液的物理 性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度，使产物转 入便于以后处理的相中（多数为液相）；除去部分 杂质。
二、发酵液的分离、过滤 1、胞外酶
通过沉降、离心分离，过滤、错流过滤等方法将发 酵液与固形物分离。 错流过滤：混合物流动方向和过滤层是平行的，混 合物流从过滤层表面上流过时，滤清液透过滤膜而 达到过滤的目的。
⑵ mRNA稳定性差的，随着细胞的停止生长而 终止酶的合成。
⑶不受培养基中阻遏物阻遏的，可随着细胞的生 长而开始酶的合成。 ⑷受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平 衡期后，解除阻遏，酶才合成。
四、延续合成型是酶的工业生产中最理想的 合成模式
对于其他合成类型的酶，可在细胞选育上或工 艺条件方面加以适当调节：
采用沉淀、吸附、萃取、超滤等方法除去与目标 产物性质有很大差异的杂质，使产物浓缩，提高 产品质量。
五、精制
精制：高度纯化 采用对产品有高度选择性的分离技术，以除去与 产物化学和物理性质相近的杂质。 典型的纯化方法有层析、电泳、亲和、离子交换 等。
六、成品加工
成品加工是为了获得质量合格的产品。 常用技术：无菌过滤、浓缩、超滤、冷冻干燥、 喷雾干燥、结晶等。
①对于同步合成型，尽量提高对应mRNA的稳 定性，如降低发酵的温度。 ②对于滞后合成型，要尽量减少阻遏物，使酶 提前合成。 ③对于中间合成型的酶，则要从提高mRNA的 稳定性和减少阻遏物两方面进行。
第四节
微生物细胞发酵产酶
一、利用微生物产酶的优点：
⑴微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种 多样。
酶合成与细胞合成同步。细胞进入对数生产期，酶 大量生产，进入平衡期后，酶合成停止。
这类酶的特点：
①其生物合成可被诱导；
②不受分解代谢物和终产物的阻遏； ③当出去诱导物或细胞进入平衡期后，酶合 成立即停止。 ④这类酶所对应的mRNA很不稳定。
2、延续合成型
酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞 进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段 时间。