第九章分子定向进化
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1）、突变引物诱变 当靶位点位于基因两端时,可设计这样一对引物扩增
目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为 目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突 变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点 进行点饱和突变。
2）、重叠延伸PCR
设计一对简并引物,使其在靶位点附近有 一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别 与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物) 组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游 片段,然后将上下游片段在靶位点处交错, 互为模板重叠延伸成全长基因。
由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在 PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般 采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。
常用点饱和突变技术特性的比较
三、非理性设计—蛋白质（酶）定向进化
（一）进化策略特征： （1）进化的每一关键步骤都受到严密控制。 （2） 除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，
还可引入一个全新的功能，来执行从不被生 物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个 新的代谢途径； （3）能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的 基本特征。
该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切 位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对 于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成 的费用,而且可对多个非邻近位点同时进 行点饱和突变。
不足之处是: (1)每个靶位点两侧需分别 设计酶切位点; (2)密码子盒两端存在重 复序列,因自连而增加突变子筛选难度。
3、基于PCR的点饱和突变
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编 码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸 分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。 它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质 设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改 造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列 令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴 定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热 稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性 等多方面性质。
新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比
原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变 筛选结果。
百度文库
DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分 子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因 家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达 产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平 上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造 新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要 通过有性PCR、交错延伸PCR完成。
变子; (4)可方便地进行多点饱和突变。
不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端 时,分段扩增的片段过小而不易回收;分 别扩增上下游片段时,不能使用具有无模 板加尾性能的pol I型耐热DNA聚合酶,而 应使用无加尾性能的高保真α型或混合 型耐热DNA聚合酶。
3、质粒扩增诱变
在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩 增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化 位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位 点而被保护。
（二）定向进化常用方法 1.易错PCR为代表的无性进化 2.DNA改组技术为代表的有性进化 3.基因家族之间的同源重组 4.杂合酶 (1)杂合酶 (2)构建策略
1、 易错PCR
是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突 变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中 某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机 错配而引入多点突变。本法的关键在于选择 适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎 无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野 生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到 理想的突变体。
费力、费时，且易出现同型碱基转换
2、 DNA shuffling
1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试 验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一
优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋 白编码基因内,通过噬菌体表面展示技 术可方便地筛选出重组子。
不足之处: (1)对19种氨基酸须分别设 计各自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大 肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因 突变修复而难以筛选出突变子; (3)不 适合多点饱和突变。
2、盒式诱变
该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切 位点序列的密码子盒(codon cassette)来引入 突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入 目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产 生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。
第八章 分子定向进化育种
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
1、寡核苷酸定向诱变
该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因 克隆到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一 段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与 目的基因配对,再加入四种dNTP和Klenow DNA 聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获 得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进 而筛选出阳性突变子。
图2 重叠延伸PCR技术流程
A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上 的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸
该法主要优点: (1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和 突变,解决中间靶位点不易突变的难题; (2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期; (3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突
目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为 目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突 变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点 进行点饱和突变。
2）、重叠延伸PCR
设计一对简并引物,使其在靶位点附近有 一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别 与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物) 组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游 片段,然后将上下游片段在靶位点处交错, 互为模板重叠延伸成全长基因。
由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在 PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般 采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。
常用点饱和突变技术特性的比较
三、非理性设计—蛋白质（酶）定向进化
（一）进化策略特征： （1）进化的每一关键步骤都受到严密控制。 （2） 除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，
还可引入一个全新的功能，来执行从不被生 物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个 新的代谢途径； （3）能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的 基本特征。
该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切 位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对 于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成 的费用,而且可对多个非邻近位点同时进 行点饱和突变。
不足之处是: (1)每个靶位点两侧需分别 设计酶切位点; (2)密码子盒两端存在重 复序列,因自连而增加突变子筛选难度。
3、基于PCR的点饱和突变
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编 码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸 分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。 它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质 设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改 造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列 令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴 定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热 稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性 等多方面性质。
新菌株,其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比
原始菌株提高了32,000倍,也远高于易错PCR的突变 筛选结果。
百度文库
DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分 子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因 家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达 产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平 上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造 新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要 通过有性PCR、交错延伸PCR完成。
变子; (4)可方便地进行多点饱和突变。
不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端 时,分段扩增的片段过小而不易回收;分 别扩增上下游片段时,不能使用具有无模 板加尾性能的pol I型耐热DNA聚合酶,而 应使用无加尾性能的高保真α型或混合 型耐热DNA聚合酶。
3、质粒扩增诱变
在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩 增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化 位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位 点而被保护。
（二）定向进化常用方法 1.易错PCR为代表的无性进化 2.DNA改组技术为代表的有性进化 3.基因家族之间的同源重组 4.杂合酶 (1)杂合酶 (2)构建策略
1、 易错PCR
是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突 变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中 某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机 错配而引入多点突变。本法的关键在于选择 适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎 无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野 生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到 理想的突变体。
费力、费时，且易出现同型碱基转换
2、 DNA shuffling
1994年,Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling的文章,首次提出了DNA改组(DNA shuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试 验对象,用DNA改组,经过三轮筛选和两次回交得到一
优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋 白编码基因内,通过噬菌体表面展示技 术可方便地筛选出重组子。
不足之处: (1)对19种氨基酸须分别设 计各自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大 肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因 突变修复而难以筛选出突变子; (3)不 适合多点饱和突变。
2、盒式诱变
该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切 位点序列的密码子盒(codon cassette)来引入 突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入 目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产 生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。
第八章 分子定向进化育种
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
1、寡核苷酸定向诱变
该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因 克隆到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一 段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与 目的基因配对,再加入四种dNTP和Klenow DNA 聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获 得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进 而筛选出阳性突变子。
图2 重叠延伸PCR技术流程
A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上 的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸
该法主要优点: (1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和 突变,解决中间靶位点不易突变的难题; (2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期; (3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突