安培酶联免疫分析法
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流动相和样品
在HPLC中流动相的选择非常重要，一方面它起载体作用，将酶催化反应的产物同样品中的其他物质如未反应的底物、蛋白质等进行分离：另一方面它还要作为电化学检测的支持电解质起导电作用，所以一般选择用导电性溶液作为流动相。一般反相色谱的流动相具有有极性，可用于电化学检测器，而正相色谱可以通过加电解液后柱、采用大体积的壁喷式检测器等方法来改善电化学检测器的适应性。另外在待测物质的氧化还原反应中常常会消耗或产生质子，因此在实验中控制流动相的pH也是十分重要的。一般来说缓冲液的浓度在0.01~0.1mol/L，其组成和pH的选择要根据待测物质的实际情况加以确定。溶剂和电解质的纯度越高，背景和噪声电流越低。
化学修饰电极也可用于HPLC的安培检测。如在玻碳电极表面镀上一层带电聚合物膜，如聚4-乙烯基吡啶或阳离子交换剂Nafion,就可以有效改善电极对相反电性被测物的分析性能。
工作电位的选择
在检测过程中工作电极电位的选择非常重要，电位较高时，待测物质反应完全，但背景电位大、噪声大选择性不好，对检测限有影响，而且工作电位与被测物质的电化学性质和流动相的组成有很大的关系。工作电位的选择可以通过循环伏安法确定，方法是将待测物质
与流动相组成的混合溶液模拟电化学检测器中的流出液，在常规电解池中用循环伏安实验来了解待测物质的电化学信息，此法较为简单。另一种准确的方法是流体动力学伏安法，它常用于安培检测器工作电位的选择，方法是在不同的电位下将被测物质的溶液重复的注入HPLC，同时用检测器记录相应的电流，得到不同电位下的电流曲线，一般是一个阶梯形的伏安图，每种物质都具有特定的半波电位和极限电流。通常工作电位选择在阶梯波的平台位置，这样被测物质可以完全反应，有效提高反应的灵敏度。
安培法中最简单、最常用的模式是在恒定的电位下测定待测物质的氧化还原电流，这种恒电位测量模式可以避免双电层充电和表面瞬变效应，因而信噪比高，可以达到很低的测定下限，还可以根据需要改变电位的各种参数，采用不同的电位脉冲检测模式如示差脉冲安培法、反向脉冲安培法、三脉冲安培法，或是采用双电极或多电极检测模式，以达到检测低浓度样品的要求。
高效液相色谱安培酶联免疫分析
高效液相色谱（HPLC）具有非常的分离效率，是一种选择性好、灵敏度高的分离分析方法。HPLC的检测器有紫外吸收检测器、示差折光检测器、电化学检测器等。由于电化学检测器具有死体积小、响应速度且具有线性响应关系好、价格便宜等优点，所以近十几年来在HPLC方面的发展十分迅速。酶催化反应后的溶液通常是混合组分，将其与HPLC联用后利用色谱加以分离并除去相应干扰物，可以有效地提高待测物质的测定灵敏度。在高效液相色谱安培酶免疫分析操作中应注意以下几个问题。
安培酶联免疫分析常用的酶-底物体系
由于安培法可以检测有电化学活性的有机物，如苯酚类，所以理论上只要酶催化反应的产物含有有些电活性基因，均可用安培法进行测定。在酶免疫分析中应用较多的是碱性磷酸酶，其酶催化水解产物为相应的醇或酚，可以用安培法进行检测，特别是电化学氧化对其测定的报道较多，采用的工作电极有碳电极、金属电极、化学修饰电极等。美国Cincinati大学的Heine-man等人在这方面做了大量工作，他们采用不同的免疫分析模式，结合不同的工作电极，以及各种电化学测定技术，测定了多种临床样品和药物。他们最早用AP电化学酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下发生水解反应生成苯酚，可在电极上氧化而产生氧化电流，氧化电流的大小同酶的浓度有关系，进而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的电化学氧化过程为不可逆过程，测定时苯酚电氧化产物会吸附在电极表面而污染电极，导致测定灵敏度下降，同时氧化电位太高而造成检测时背景电流较大，所以采用其他底物的报道日益增多。已被研究的底物有对氨基磷酸苯酯、对甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解产物均为酚类物质，可以用安培法测定其氧化电流的大小进而测定其酶的活力。
安培酶联免疫分析法
安培法是酶联免疫分析中另一种常用的电化学分析技术。它是将工作电极的电为控制在被测定物质能发生氧化/还原反应的某个确定电位上，当样品中含有该物质时，就会产生可以检测的电流，通过电流的大小就可以对该物质的浓度进行测定。由于该方法常应用在色谱和流动体系的电化学检测器上，所以又称为控制电位安培检测。当色谱和流动体系中分离流出的化合物经过该检测器时，可根据所产生的电流来判断吧被测物质流出的时间，根据电流峰的大小来判断化合物的浓度。由于电化学检测器的灵敏度高、死体积小，所以在色谱和流动分析中应用广泛。只要具有电话性的物质都可以进行测定，如苯酚类、硫醇类、硝基化合物、亚胺类、醌类、吩噻嗪类有机物，可以根据所测定的化合物的电化学性质选择相应的测定电位。
安培检测有薄层式、管式和喷壁式，有关检测器的设计可参见相关专著。一般来说检测器的电解池设计应满足以下要求：具有高灵敏度和高准确性，死体积小，结构简单，易于维护和保养。流动体系或安培检测器大体被分为二类：一类是在检测过程中，只有1%~10%的分析物被电解，称为安培检测器：另一类是检测过程中分析物100%被电解称为库仑检测器，不管哪一种类的检测器，都必须在施加一个工作电为的同时检测相应的电流。由于电化学反应过程仅发生在电极表面而不是整个体系内，所以死体积的减小并不影响检测的灵敏度。
生物样品中常会含有蛋白质等大分子，在酶免疫分析过程中也可能因为抗原抗体复合物的解离而使样品中存在抗原、抗体等大分子物质，这些物质的存在可能会对分离柱或电极产生污染或毒害，所以有时为了检测的要求需对样品进行纯化或预先净化。净化过程常用沉淀法将蛋白质去除，或采用一个前柱来进行样品净化处理。
工作电极
待测物质的电化学行为会因为工作电极材料的不同而有区别，而且不同的电极材料的背景电流也会有所不同，因此要根据待测物质的氧化还原性质来选择检测器的工作电极。常用的电极有玻碳电极、碳糊电极、铂电极、金电极、汞电极以及不锈钢电极等。玻碳电极是最常用的工作电极，它具有较宽的电位范围，可以在正电位范围内检测被测物质的氧化电流，而且对普通有机溶剂呈惰性，气体也不能参透，缺点是电极表面易于发生电聚合而造成污染，因此，每次测定前都要仔细处理使表面呈镜面，以保证测定的重现性。碳糊电极也常用作工作电极，其背景电流低、噪声较小、电极成本低，缺点是在含有机溶剂的流动相中胶黏剂会逐渐溶解。
在HPLC中流动相的选择非常重要，一方面它起载体作用，将酶催化反应的产物同样品中的其他物质如未反应的底物、蛋白质等进行分离：另一方面它还要作为电化学检测的支持电解质起导电作用，所以一般选择用导电性溶液作为流动相。一般反相色谱的流动相具有有极性，可用于电化学检测器，而正相色谱可以通过加电解液后柱、采用大体积的壁喷式检测器等方法来改善电化学检测器的适应性。另外在待测物质的氧化还原反应中常常会消耗或产生质子，因此在实验中控制流动相的pH也是十分重要的。一般来说缓冲液的浓度在0.01~0.1mol/L，其组成和pH的选择要根据待测物质的实际情况加以确定。溶剂和电解质的纯度越高，背景和噪声电流越低。
化学修饰电极也可用于HPLC的安培检测。如在玻碳电极表面镀上一层带电聚合物膜，如聚4-乙烯基吡啶或阳离子交换剂Nafion,就可以有效改善电极对相反电性被测物的分析性能。
工作电位的选择
在检测过程中工作电极电位的选择非常重要，电位较高时，待测物质反应完全，但背景电位大、噪声大选择性不好，对检测限有影响，而且工作电位与被测物质的电化学性质和流动相的组成有很大的关系。工作电位的选择可以通过循环伏安法确定，方法是将待测物质
与流动相组成的混合溶液模拟电化学检测器中的流出液，在常规电解池中用循环伏安实验来了解待测物质的电化学信息，此法较为简单。另一种准确的方法是流体动力学伏安法，它常用于安培检测器工作电位的选择，方法是在不同的电位下将被测物质的溶液重复的注入HPLC，同时用检测器记录相应的电流，得到不同电位下的电流曲线，一般是一个阶梯形的伏安图，每种物质都具有特定的半波电位和极限电流。通常工作电位选择在阶梯波的平台位置，这样被测物质可以完全反应，有效提高反应的灵敏度。
安培法中最简单、最常用的模式是在恒定的电位下测定待测物质的氧化还原电流，这种恒电位测量模式可以避免双电层充电和表面瞬变效应，因而信噪比高，可以达到很低的测定下限，还可以根据需要改变电位的各种参数，采用不同的电位脉冲检测模式如示差脉冲安培法、反向脉冲安培法、三脉冲安培法，或是采用双电极或多电极检测模式，以达到检测低浓度样品的要求。
高效液相色谱安培酶联免疫分析
高效液相色谱（HPLC）具有非常的分离效率，是一种选择性好、灵敏度高的分离分析方法。HPLC的检测器有紫外吸收检测器、示差折光检测器、电化学检测器等。由于电化学检测器具有死体积小、响应速度且具有线性响应关系好、价格便宜等优点，所以近十几年来在HPLC方面的发展十分迅速。酶催化反应后的溶液通常是混合组分，将其与HPLC联用后利用色谱加以分离并除去相应干扰物，可以有效地提高待测物质的测定灵敏度。在高效液相色谱安培酶免疫分析操作中应注意以下几个问题。
安培酶联免疫分析常用的酶-底物体系
由于安培法可以检测有电化学活性的有机物，如苯酚类，所以理论上只要酶催化反应的产物含有有些电活性基因，均可用安培法进行测定。在酶免疫分析中应用较多的是碱性磷酸酶，其酶催化水解产物为相应的醇或酚，可以用安培法进行检测，特别是电化学氧化对其测定的报道较多，采用的工作电极有碳电极、金属电极、化学修饰电极等。美国Cincinati大学的Heine-man等人在这方面做了大量工作，他们采用不同的免疫分析模式，结合不同的工作电极，以及各种电化学测定技术，测定了多种临床样品和药物。他们最早用AP电化学酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下发生水解反应生成苯酚，可在电极上氧化而产生氧化电流，氧化电流的大小同酶的浓度有关系，进而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的电化学氧化过程为不可逆过程，测定时苯酚电氧化产物会吸附在电极表面而污染电极，导致测定灵敏度下降，同时氧化电位太高而造成检测时背景电流较大，所以采用其他底物的报道日益增多。已被研究的底物有对氨基磷酸苯酯、对甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解产物均为酚类物质，可以用安培法测定其氧化电流的大小进而测定其酶的活力。
安培酶联免疫分析法
安培法是酶联免疫分析中另一种常用的电化学分析技术。它是将工作电极的电为控制在被测定物质能发生氧化/还原反应的某个确定电位上，当样品中含有该物质时，就会产生可以检测的电流，通过电流的大小就可以对该物质的浓度进行测定。由于该方法常应用在色谱和流动体系的电化学检测器上，所以又称为控制电位安培检测。当色谱和流动体系中分离流出的化合物经过该检测器时，可根据所产生的电流来判断吧被测物质流出的时间，根据电流峰的大小来判断化合物的浓度。由于电化学检测器的灵敏度高、死体积小，所以在色谱和流动分析中应用广泛。只要具有电话性的物质都可以进行测定，如苯酚类、硫醇类、硝基化合物、亚胺类、醌类、吩噻嗪类有机物，可以根据所测定的化合物的电化学性质选择相应的测定电位。
安培检测有薄层式、管式和喷壁式，有关检测器的设计可参见相关专著。一般来说检测器的电解池设计应满足以下要求：具有高灵敏度和高准确性，死体积小，结构简单，易于维护和保养。流动体系或安培检测器大体被分为二类：一类是在检测过程中，只有1%~10%的分析物被电解，称为安培检测器：另一类是检测过程中分析物100%被电解称为库仑检测器，不管哪一种类的检测器，都必须在施加一个工作电为的同时检测相应的电流。由于电化学反应过程仅发生在电极表面而不是整个体系内，所以死体积的减小并不影响检测的灵敏度。
生物样品中常会含有蛋白质等大分子，在酶免疫分析过程中也可能因为抗原抗体复合物的解离而使样品中存在抗原、抗体等大分子物质，这些物质的存在可能会对分离柱或电极产生污染或毒害，所以有时为了检测的要求需对样品进行纯化或预先净化。净化过程常用沉淀法将蛋白质去除，或采用一个前柱来进行样品净化处理。
工作电极
待测物质的电化学行为会因为工作电极材料的不同而有区别，而且不同的电极材料的背景电流也会有所不同，因此要根据待测物质的氧化还原性质来选择检测器的工作电极。常用的电极有玻碳电极、碳糊电极、铂电极、金电极、汞电极以及不锈钢电极等。玻碳电极是最常用的工作电极，它具有较宽的电位范围，可以在正电位范围内检测被测物质的氧化电流，而且对普通有机溶剂呈惰性，气体也不能参透，缺点是电极表面易于发生电聚合而造成污染，因此，每次测定前都要仔细处理使表面呈镜面，以保证测定的重现性。碳糊电极也常用作工作电极，其背景电流低、噪声较小、电极成本低，缺点是在含有机溶剂的流动相中胶黏剂会逐渐溶解。