8第四章 环境分析中的色谱法 上

固定相为液体：Liquid–liquid Chromatography
• 流动相为超临界流体：Supercritical Fluid Chromatography
• 气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。 固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。
• 气液(液液)色谱的固定相: 由担体和固定液所组成。
• 1941年，他们提出了用气体代替流体做流动相的可能性，
发展了完整的气液色谱法之后，得到了1952年的诺贝尔化 学奖。
• 1957年，Golay发展了开管柱气相色谱。
• 上个世纪六十年代末，高压泵和键合相固定相结合，出
现了高效液相色谱。 • 接着，出现了色谱法和其他检测技术的联用，例如GC-
MS、 GC-IR等。
导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。 当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小 ) ，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所 得色谱峰越窄。
不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数
和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物 质。
塔板理论的局限： 塔板高度H是一个抽象的物理量，对实验指导意义有限。 有些假设不合理，没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响。 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的 分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法 分离。 无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实 验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此
在同一推动力作用下, 不同组分在固定相中滞留的时间有 长有短,按先后不同次序从固定相中流出。 与适当的柱后检测方法结合， 实现混合物中各组分的分离 与检测。
三、色谱法的发展
• 1906年，俄国植物学家T.swett命名自己发明的分离植物 色素的新方法为色谱法。 • 1931年，德国的Kuhn和Lederer重复了T.swett的实验，得 到很好的结果，色谱法因此得到很大的推广。 • 1940年，Martin和Synge提出了液液分配色谱法，又把塔 板的概念引入色谱法中，初步建立了塔板理论。
固定液与流动相中的浓度之比。
一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果；
某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
分配比k：又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在 一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与 在流动相中的量之比值。 相比β：色谱柱内流动相和固定相体积之比，是柱型及 结构的重要特性。
n是峰相对展宽的量度
n是柱效的量度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 n是常数时，Y与tR成正比
n越大，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，
对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。
有效塔板数和有效塔板高度 保留时间包含死时间，组分在死时间内不参与柱内分配
需引入有效塔板数和有效塔板高度：
分配系数、分配比都与组分及固定相的热力学性质有关 ，随柱温及柱压的变化而变化。分配比还与相比有关。
滞留因子： Rs=us/u
us: 组分在柱内的线速度 u: 流动相在柱内的线速度
滞留因子也可以用质量分数表示
假设色谱长度为L 则组分和流动相通过色谱所需要的时间分别为：
由上各式可知
故k可有实验测得。
固定相对这两种组分的选择性。
保留指数（I）：表示物质在固定相上的保留值行为。规定正 构烷烃的保留指数是其碳数的100倍，其它物质的保留指数在
实际色谱条件下测定。选取与被测物相邻的两种正构烷烃做
参照系，其中一种碳数为Z，另一种为Z+1，被测物的保留指 数由下式计算
3、关于分配平衡 分配系数K：一定温度和压力下，在平衡状态下，组分在
液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处：
被分离组分的定性较为困难。
六、色谱相关术语
1、关于色谱峰
2、关于保留值 3、关于分配平衡
1、关于色谱峰
色谱图和色谱峰：若干物质通过色谱柱的流出曲线，在不同时间 上的浓度或响应的大小。 基线：在色谱操作条件下，没有被测组分通过鉴定器时，记录器 所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。 峰面积：流出曲线（色谱峰）与基线构成之面积称峰面积。 峰高：由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间 的高度称为峰高。 色谱峰底宽W ：由色谱峰的两边拐点做切线，与基线交点的距离 半峰高宽度W½ ：色谱峰高一半处的峰宽。也称为色谱峰半高宽 度 标准偏差：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 峰底宽、半峰宽及标准偏差的关系：W= 4σ，Wh/2=2.354 σ
七、色谱分析法基本理论 • 研究理论的目的 解决色谱峰的分离问题 • 三个色谱基本理论问题 色谱热力学问题——发展高选择性色谱 色谱动力学问题——发展高效能色谱 分离条件的最解决的问题： 色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及
柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指
固定相颗粒越小 dp↓ ，填充的越均匀， A↓ ， H↓ ，柱效 n↑ 。 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
② B/u —分子扩散项 B=2γdg γ: 弯曲因子，填充柱色谱,γ<1。； dg: 试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2· s-1） 由于分子的纵向扩散造成的色谱峰展宽。由于试样组 分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色谱柱的 很小的一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此 使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。 (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
第四章 环境分析中的色谱法
第一节 色谱 (chromatography)
一、色谱法
茨维特： 俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作， 在1906年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。
茨维特的实验
试样混合物的分离过程 也就是试样中各组分在称之 为色谱分离柱中的两相间不
断进行着的分配过程。
其中的一相固定不动，称为 固定相；
标及其关系。
组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？
• 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质）
• 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；
（两相中的运动阻力，扩散）
1、色谱动力学理论 研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素 （1）塔板理论 将色谱柱比作精馏塔，将连续的色谱分离过程分割成多次的 平衡过程的重复，通过概率理论的到流出曲线方程
（2）速率理论 运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰展 宽的因素，导出理论塔板高度与流动相线速度的关系， 揭示了影响塔板高度的动力学因素。
H=A+B/u+Cu
H：理论塔板高度，
u：载气的线速度(cm/s)
减小A、B、C三项可提高柱效；
存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？
① A-涡流扩散项 A=2λdp λ:固定相的填充不均匀因子；
• 当t=tR，C=Cmax，峰高正比与进样C0，是峰高定量的理论基础 • n越大，σ越小， Cmax越大，即保留时间一定时，塔板数 越多，峰越高。 • n一定， Cmax反比于tR， tR越小， Cmax越大，保留时间小的组 分 高且窄。tR越大， Cmax越小，保留时间大的组分峰低且宽。
柱效参数： 由流出曲线方程导出
3、按分离原理分类
• 吸附色谱（adsorption chromatography)
吸附剂对被分离物质的吸附能力不同
• 分配色谱 (partition chromatography) 被分离物质在两相中分配系数不同
• 离子交换色谱(ion-exchange chromatography)
被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同 • 尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography ）
保留体积（VR）：从注射样品到色谱峰值出现时，通过色谱系
统的流动相的体积。用保留时间乘流动相线速度得到。 调整保留体积（V’R）：用调整保留时间乘流动相线速度得到。
相对保留值（ri,s）：以一种物质作为标准，而求出其他物质
的保留值对此标准物的比值，称为相对保留值。该值只与柱 温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了
另一相是携带试样混合物流
过此固定相的流体（气体或 液体），称为流动相。
• 色谱法是一种分离方法。 —它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动 相，两相作相对运动。
• 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。
—色谱分析是一种分离、分析法。
二、色谱法的分离原理
当流动相中携带的混合物流过固定相时, 就会与固定 相发生作用（力的作用）。由于混合物种各组分在性质和
固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 • 气固(液固)色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程； • 气液(液液)色谱的分离机理： 两相间的反复多次分配过程。
2、按固定相形式分类 • 柱色谱 （Column Chromatography) 将固定相装在色谱柱内 • 纸色谱（Paper Chromatography) 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱 • 薄层色谱（Thin Lay Chromatography) 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上
dp:固定相的平均颗粒直径
由不等路径造成的色谱峰展宽。由于柱填料粒径大 小不同，粒径分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽
窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊
乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的粒径运行， 以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些
分子发生滞后，从而使色谱峰发生扩散。
拖尾峰：前沿陡峭，后沿较平缓的不对称峰。 伸舌峰：前沿平缓，后沿较陡峭的不对称峰。 鬼峰、假峰：在谱图中出现的一种有规律的峰，规律性强， 间隔均匀，不易消除，并非由试样所产生的峰。 基线噪声：由于各种因素所引起的基线波动。
基线漂移：单方向的，固定斜率的基线变化。正漂移、负漂移。
谱带扩张：指试样组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。
tR 2 tR 2 n理 5.54( ) 16( ) Y1 / 2 Wb
' ' tR t n有效 5.54( ) 2 16( R ) 2 Y1 / 2 Wb
H 有效
L n有效
用不同物质计算可得到不同的塔板数。
塔板理论的贡献：
有助于形象的理论色谱的分离过程。
导出色谱流出曲线方程，符合高斯分布与实验现象相吻合
被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同
• 亲和色谱(affinity chromatography) 生物大分子和固定相表面存在特异性亲和力不同
4、按色谱动力学过程分类
• 淋洗法(elution method)
流动相与固定相的结合比样品与固定相的结合弱，分为等 度淋洗和梯度淋洗。是目前色谱中最普遍的方法。 • 臵换法(displacement method) 流动相与固定相的结合比样品与固定相的结合强。 • 前沿法(frontal method） 样品本身就是流动相，固定相上吸附或者溶解力最弱的最 先流出，后面的就是混合物了。
五、色谱法的特点
（1）分离效率高
复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快
一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广
气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。
• 上个世纪八十年代，毛细管电泳出现，此后得到长足的发 展，并不断出现新的模式。
四、色谱法的分类
1、按流动相状态分类 • 流动相为气体： 固定相为固体：Gas–solid Chromatography 固定相为液体：Gas–liquid Chromatography • 流动相为液体： 固定相为固体：Liquid–solid Chromatography
2、关于保留值
保留值：表示试样中各组分在色谱柱中的停留时间的数值，通
常用时间或用将组分带出色谱柱所需流动相的体积来表示。
死时间（tM）：不被保留的样品通过色谱柱的时间。 保留时间（tR）：样品注入到色谱峰顶出现的时间。
调整保留时间（t’R）：保留时间减去死时间等于调整保留时间
死体积（VM）：不被保留的样品通过色谱柱所消耗的流动相的 体积。死时间与流动相线速度的乘积。