病毒性肝炎标志物检测(沈云松)

四、 如何判断“可疑”
“阳性”在理论上的概念是“存在”，然而在实践中， 因其受方法、灵敏度、精密度、种族、社会环境的 影响，所以具有相对性（5ng、2ng、0.5ng）
。
阈值附近理论上是个盲区，不易截然分为阴性和阳 性。国外厂家均要求对这部分可疑标本进行奇数次 复查，以次数多者为准（通常3次），但实际上是 难定的，只能判为可疑。美国联邦药品食品管理局 （FDA）规定阈值±0.05均判为可疑。我国临检中 心亦有阴、阳、可疑三种判断结果。我们目前的办 法是建议追踪观察。
6) 交叉反应物质 某些药物可导致非特异性吸附。 类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉 反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果 影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如 果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对 应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
7) 标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红 素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测 定结果有干扰作用。在报告单上注明标本的状 态是可取的
病毒性肝炎标志物检测的 质量保证
沈云松
几个概念
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质量保证 室内质量控制 室间质量评价 准确度 偏差 精密度
室内质量控制
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一、测定前的质量控制：实验室的环 境、设施和设备 二、理想的测定试剂和方法 三、人员培训
统计学质量控制
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一、室内质控样本的选择：基质效应， 浓度水平，稳定，无已知传染危险性， 靶值已定，容易获得，价格可以接受。 二、质控物浓度的选择：3SD＞1也即2-4 倍cutoff值浓度作为室内质控管理体系， 另选择S/CO=1.5左右作为测定下限。
内源性物质
有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干 扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰 物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗 原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig（s）抗体、交 叉反应物质和其它物质等。
1) 类风湿因子 人血清中IgM、IgG 型类风湿因子 （RF）可以与ELISA系统中的扑获抗体及酶标 记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。解 决该情况的办法是：（1）用 F（ab）2 替代完 整的 IgG；（2）标本用联有热变性（63℃， 10min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加 入到标本稀释液中同样有效）；（3）检测抗原 时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中， 使RF降解。
4) 标本凝集不全 在没有促凝剂和抗凝剂存在的 情况下，正常血液采集后1/2~2h开始凝固， 18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了 争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时 即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部 分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉 眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这 类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不 在有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。 为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液 标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清， 或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管 中加入适当的促凝剂。
综上所述，对临床检验ELISA测定中出现 的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操 作因素之的外，更多应从标本因素方面进行分 析并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临 床提供正确可靠的检测结果。
三、影响EIA重复性的因素
一、目视试剂盒的不准确性 阳性对照浓度太高（-、+之间反差 大）界于-、+之间飘忽不定致使忽-忽+ 若以临界值5ng/ml或2ng/ml做阳性 对照，目视分辨率不高，受主观影响大， 精密度不高，为Lab之大忌
3. 漏加酶标二抗、底物显色剂或作用时间不够， 作用温度不够等均可导致假阴性。 4. 试剂质量不佳，保存不当，超失效期了，运输 不当（温度、湿度、运期）蒸馏水质不纯。尤 为在不设阳、阴性对照的情况下，极易报出假 阴性。 5. 大批量样本的检测情况下，先加显色剂的孔呈 色较早，由于工作量大，观察结果时超过了时 间，或由于工作疏乎错过观察时间，这样对于 易褪色的反应造成假阴性，反之致假阳性。
ELISA测定操作中的注意事项
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七、读取吸光度 八、结果判定 九、结果报告及解释
乙肝标志物临床常见模式
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
S + + — + — — — — —
抗 S — — — — — + + + —
e
+ — — — — — — — —
抗 e — + + — — + — — —
一、造成假阴性的原因
1.
2.
产试剂的厂家资金不足，设备落后，尤 为在人工包被的情况下，生物活性材料 不同于普通试剂。发生“漏包”现象或包 被的抗原（抗体）活性不足或失活。 漏加样品或加样量不足，（尤为在阈值 左右的）。ELISA 法只用微量样品，少 加或多加 1μl样品就会导致处于临界值 的标本忽阴忽阳，因此加样技术是关键。
二、造成假阳性的原因：
1. 吸附作用：自身免疫病（SLE、类风湿）患者的血清中 某些特殊组分，例如：IgG抗体，属抗抗体，也会对包被 板轻微吸附，因聚苯乙烯板对蛋白质吸附是非特异的， 致一些阴性标本显色。以HCV抗体检测为例：包被基因 工程抗原和合成肽成分，基因工程抗原多为融合蛋白。 个别标本中的IgG对融合蛋白轻微吸附，经反应而呈色。 因此间接ELISA法通过提高阈值的方法来排除非特异性 反应。国内外丙肝试剂盒的阈值一般在0.20~0.45之间。 Abbott公司定在0.32。事实上显色值在0.15±时，目视到 可见颜色了。即：间接ELISA法，由于方法学本身的限 制（不如双特异性的双抗夹心法）不可避免地会出现阴 性标本的显色情况。不能一显色就判为阳性，否则就叫 假阳性。
抗c + + + + + + + — —
出现率 %
说明 急肝，慢性活动期，有传染性 慢性携带者，弱传染性 恢复期，弱传染性 急肝或慢性HBsAg携带者 急性窗口期或既往感染过 康复期 既往感染过，仍有免疫力 康复期，主动、被动免疫后 未感染过HBV
30+ 10+1010+10510+ 5+10+-
常见造成假阳性假阴性的原因
4) 嗜靶抗原的自身抗体 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛 素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结 合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗 体测定结果。为避免以上情况出现，解决的办 法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。
5) 医源性诱导的抗鼠Ig（s）抗体 临床开展的用 鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素 标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技 术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体； 另外，被鼠等 齿类动物咬伤的病人体内也可以 产生抗鼠Ig（s）抗体。这些病人ELISA测定时 均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原 时，在标本中加入足量的正常鼠Ig（s），从而 克服由于上述原因造成的假阳性。
4、底物被污染（批或个别孔吸管头不洁净）或 底物受光照时间过久（加前5分钟现配，提前10分 钟从冰箱取出）是导致假阳性的常见原因。
5、实验操作时差的影响 定义：加入样品、试剂及混匀时间的差异称为操作时 差。 操作时差在每个试验中都存在，尤为手工操作更著， 对结果都会产生或大或小的影响。 Elisa常用项目，例如：乙肝两对半，多是成批检测。 从加第一个样本到最后一个样本，包括中间换吸管尖 的工作，需数十分钟；加试剂及混匀也同样存在着前 后的时间差异，致使抗原抗体反应和酶促反应时间上 的不一致，对竞争法模式的项目影响更大。若不注意 操作，时差会导致假阳性或假阴性的结果。
5) 标本管中添加物质的影响 抗凝剂（如肝素， EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根 过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对 ELISA测定有一定干扰作用。
2、处于临界值的样品，加样量多了
3 、冲洗不当，邻近的强阳性标本的扩散污染。 洗涤不充分，样品中其它成分残留或酶残留
三、操作环节
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1.样品数时多时少，加样时间与流程用 时长短不一，为手工法之缺陷 2.加样后未混匀 3.不同批号间的试剂不要混用（批间差） 4.试剂瓶盖张冠李戴 5.冒名顶替 6.保温的温度与时间、洗涤方法、显色 条件不一致
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7.边缘效应致四角周边孔较中央孔为深 （受光不同） 8.污染（吸头、板、样本、试剂、震荡 溅出） 9.阈值附近时阴时阳，重复奇数次，以 偶数结果为准
2) 标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣 根过氧化酶，因此，被细菌污染的标本同溶血 标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定 结果。
3) 标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血 清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体， 在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造 成假阳性；标本放置时间过长（如一天以 上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出 现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清 标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测 定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清 标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质 局部浓缩，分布不均，应充分混合后在测定， 但混匀时应轻柔，不要强烈振荡。
确立靶值、控制线
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一、OCV 二、Rபைடு நூலகம்V
失控分析
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系统误差：22s ，41s ，10X 仪器、试剂 随机误差： 12s ， 13s ， R4s 操作中
EQA
操作客观 及时回报 符合要求 清楚明白
ELISA测定操作中的注意事项
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一、临床标本的收集和处理 二、试剂准备 三、加血清样本及反应试剂 四、温育 五、洗板 六、显色
2) 补体 ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程 中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子 结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者连接起 来，从而造成假阳性。解决的办法是：（1）用 EDTA稀释标本；（2）用53℃，10min加热血清 使C1q灭活。
3) 嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物 （如鼠等）Ig（s）结合的天然嗜异性抗体，可 将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成 假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加 入过量的动物Ig（s），但加入量不足或亚类不 同时无效。
使用酶标仪的优点是可以分段记录这部分可疑结 果，但解释起来颇费口舌。 国外第一次阳性报：Reactive 国外第二次阳性报：Repeat Reactive 国外第三次阳性报：Positive
乙型肝炎病毒HBV血清学几种罕见模式
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外源性物质
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外源性物质常常是由于用于ELISA测定的 血标本的采集、 存等不当所致。如标本 溶血、标本被细菌污染、标本储存过久、 标本凝集不全和采血管中添加物等影响。
1) 标本溶血 由于各种人为原因引起的标本溶血， 均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧 化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶 为标记的ELISA测定中会导致非特异性显色，干 扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集 时必须注意避免溶血。
二、器具、仪器的因素
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1.酶标板——材质、厚度、划痕、水汽 2.加液器——准确性、精密度、定期校 正、吸管头之匹配 3.洗板机的必要性 4.酶标仪——光源 ——λ Range
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——A Range ——测A方式（单、双） ——线性 ——精密度（机械定位的重复性、持久性） CV<1% ——λ准确性（干涉滤光板的峰值λ和半带 宽）将影响TEST的灵敏度。错用对灵、精都有 影响 ——零漂（稳定性）ΔA≤0.005A/h ——分辨率（灵敏度）0.001A
6. 样品加Na2N3防腐抑制了酶活力 7. 目前多数厂家所提供的阳性对照为使阴、阳性分 明，采用高浓度、强阳性。这是造成假阴性的主 要原因。因此了解流行病学是重要的。重复性好、 灵敏度低的倾向应引起关注。有的试剂盒可漏掉 5%的阳性率。故建议：检测HBsAg时，2IU/ml、 1IU/ml的临界值血清是必须要做的。这是目视法 不准的主要所在，所以必须使用酶标仪来判读结 果。 8. 洗涤冲击力过大，洗涤液浸泡时间过久或洗涤次 数过多，可以导致假阴性，因此洗板机的配套是 必要的。