透明质酸的分离纯化研究进展

透明质酸的分离纯化研究进展

沈自慧

（烟台大学生命科学学院烟台264005）

摘要：综述了透明质酸的的理化性质和生理功能，介绍了透明质酸的生产工艺，对预处理、分离、纯化各阶段的工艺方法进行了系统比较和分析。

关键词：透明质酸；生产工艺；分离纯化

Research progress on separation and purification of hyaluronic acid

SHEN Zi-hui

(School of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005)

Abstract：The physical and chemical properties and the physiological functions of the hyaluronic acid have been reviewed. Techniques of production have also been introduced. Techniques in pretreatment, separation and purification stages have been analyzed systematically.

Key words：hyaluronic acid; separation; purification

透明质酸（玻璃酸）(Hyaluronic Acid，HA) 是一种由β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖交替聚合而成的高分子线性多糖。HA主要存在于鸡冠、软骨、脐带、皮肤、眼玻璃体、关节润滑液等中，由于其特有的保水性、润滑性和流变学特性，已被广泛应用于医学、化妆品等领域[1,2]。

1 透明质酸的生产工艺

HA的生产工艺主要分为两类：一类是从动物组织中提取；一类是通过微生物发酵获得，相比较见表1.

表1提取法与发酵法生产HA的比较

Tabl .The comparison of extraction method and fermentation method 项目提取法发酵法

存在状态在原料中与蛋白质和其他多糖形成复合体，

分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精

制容易

品质与产量取决于动物的品质和数量品质稳定，产量大

分子量与保

湿性

<10×105Da, 保湿性差>15×105Da, 保湿性强价格高低

应用范围较小广

其中从动物组织提取的工艺已相当成熟，但迫于组织来源困难价格昂贵，且得到的动物生化产品存在病毒交叉感染的风险性，目前发酵法生产HA替代组织培养提取法已成为趋势。

尽管近年来发酵法生产HA发展迅速，但我国目前的HA生产能力远不能满足市场需求，尤其高分子量的药物级别HA更需要从国外进口，因此急需解决提高HA产量和分子量的问题。

2 透明质酸的分离纯化

分离纯化的主要目的是获得纯度较高的HA，目前国内外一般以葡糖醛酸含量表示HA 的纯度，保健食品及化妆品级HA的葡糖醛酸含量为35%～45%，药用级为42%～48%[2]。生物发酵法制得的药用级HA蛋白质含量不应大于0.1%（质量分数），细菌内毒素限量应小

于1 EU/mg，溶血率应不大于5%[3]。针对HA发酵液的特性，分离纯化方法很多在不同阶段所适用的分离纯化技术不尽相同，但总体上分离纯化工艺过程可以概括为如下流程：发酵液→预处理→分离（初步纯化）→纯化→干燥→成品

2.1 发酵液的预处理

HA发酵液粘稠，不易将HA与菌体快速有效地分离，而菌本身产生的透明质酸酶，会使HA降解，从而降低HA的分子量。因此在从发酵液中提取HA之前，需要对发酵液进行预处理，使其中的透明质酸酶失活，防止HA分子量损失。

预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。

2.1.1 灭酶

史鹏等[4]采用两种预处理方式进行灭酶，热处理方式为发酵液在70 ℃下保温1 h，静置5 h；酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调pH值至4.5，1 h后回调至6.0，静置5 h，其中酸处理能更有效的抑制透明质酸酶的活性。

2.1.2 灭菌

杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，能够使HA逐渐从细胞膜上脱落[5]，使蛋白质变性沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使HA产品安全性提高[6]。采用加热进行灭菌，灭菌温度一般为75~80 ℃[7]。

2.1.3 除菌

除菌的方法较多，邓禹等[8]采用25 g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以混合硅藻土为过滤助剂，再配以特定的后处理工艺，所得成品透明质酸中蛋白质含量仅为0.047%。郭育涛等[5]采用发酵液中加入2倍体积的氯仿除菌体的方法，在28 ℃、pH值为7.0的条件下搅拌60 min，离心后，HA提取率达97.5%，纯度达97.3%。盛瑞堂等[9]采用过滤法除去菌体，并发现使用硅藻土作吸附剂时的滤液浊度和终滤液HA收率优于活性炭。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用。

2.2 分离纯化工艺

2.2.1 过滤法

过滤法纯化是一种简单有效并可以规模化生产HA的纯化方法，能有效去除菌体和杂蛋白，对分子量影响相对要小。邓禹等[8]将发酵液经过前处理后，以发酵液质量 1.2%的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为60 ℃，pH值为7.0，再配以酒精沉淀、气浮、酒精造粒的后处理工艺，得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%，蛋白质含量仅为0.047%，相对分子质量为190万，提取收率为91.3%。这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质酸发酵液预处理方法。

2.2.2 乙醇沉淀法

乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色，从而提高HA 产品品质[7]。为了使HA完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常加入浓度为1%左右的NaCl或NaAc以达到适宜的离子强度。乙醇添加量一般为发酵液体积的2倍[5]，如果乙醇添加量足够大，HA浓度低至0.1%也可沉淀完全[10]。HA溶液具有较高的黏度，乙醇沉淀时如果HA浓度过高，沉淀趋向于糖浆状而难以分离；如果浓度过低，所需乙醇量偏大，不利于降低成本[6]。预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，HA 常因稀释而浓度较低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩可以减少乙醇用量。盛瑞堂等[9]采用超滤法对过滤后的发酵液进行浓缩，使HA溶液体积减少了67.1%，相应的乙醇用量降低了67.1%。在浓缩发酵液的同时，超滤还可以去除一些小分子杂蛋白，有利于后期