单克隆抗体

建立产生McAb的B淋巴杂交瘤的 原理
细胞融合 Kao(1974)用PEG（聚乙二醇）对动物、 植物及细菌等作融合试验证明，PEG的融合效果较仙台病毒理想，可以
明显提高融合率，作用快，不使细胞溶蹦。（其它的融合技术包括电融 合、激光融合）。
杂交瘤细胞的产生 两个细胞融合时，首先是细胞膜融合，形成一个有两个或两个以上细胞
杂交瘤细胞保存较困难，杂交瘤细胞易丢失产生抗体的能力或死亡。
单克隆抗体的应用及展望
单克隆抗体为识别和分离各种细胞提供了探针，从而能详细研究 共同作为免疫应答的组成部分的相互作用的各种细胞的混合物。
用单克隆抗体分析兴奋或抑制的膜受体，并探测它们的功能位点。 在这一领域中，单克隆抗体和DNA与RNA探针被用作互补的工 具。
单克隆抗体是一个单一的，可以测定氨基酸的顺序的蛋白质，纯 度高，可以大量、快速、连续生产，并且是同质的抗体。 单克隆是针对单一决定簇的，因此只要有一组抗体，就容易区别 两种近似物质之间的差异。可用于菌株、毒株的鉴别，细胞表面 抗原的研究。
单克隆抗体的基本概念：
抗体主要由B淋巴细胞合成
每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万 种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同 的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具 有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子 孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合 成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养， 就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克 隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克 隆抗体（monoclonal antibody, McAb）。
单克隆抗体是由单个B细胞形成的一个群体（称为克 隆或细胞系），由这样的细胞产生的抗体，其结构相 同，成分均一，特异性强，生物学活性高。
B淋巴细胞杂交瘤的创建与两项技术的发展密切相关：
1. 骨髓瘤细胞株的建立：这类细胞是由某种抗体合成细胞演变的 肿瘤细胞。Sachs（1965）用矿物油刺激BALB/c小鼠诱生成功 骨髓瘤，且可在体外培养。如SP2/O及NS-1细胞等。
2. 细胞融合技术：1965年Harris最先成功地用仙台病毒将体外培 养的HeLa细胞和小鼠艾氏腹水癌细胞融合成一个杂交细胞，表 明不同动物细胞可融合成具有双方亲代细胞特性的杂种细胞。同 时，Littlefield（1964）创立筛选杂种细胞的选择培养基。
单克隆抗体
前言
抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分 子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗 体实为多种抗体的混合物。
用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物 抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这 些不同的抗体分开也极困难。
单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大米尔斯坦在Jerne个体基因型网络学说的启 迪下，于1975年8月7日在Nature杂志上发表文章，并宣布了单 克隆抗体的研究成功。1984年两人于Jerne一起获得诺贝尔奖。
科勒1974年（28岁）在研究抗体基因突变中发现，小鼠的免疫 系统对一种抗原分子上的一个表位，就可可以产生上千种的抗体 分子，于是他对抗体基因突变产生了兴趣，并于米尔斯坦进行合 作，把Jerne的科学幻想作为科学假说，选取经绵羊红细胞免疫 的小鼠脾细胞和在体外培养中能持续繁殖的小鼠骨髓瘤细胞系作 为融合材料，以期得到具有两种亲本细胞各自的特点的杂交细胞， 经7年的努力，终于在1974年建立了能够分泌单克隆抗体的B淋 巴细胞杂交瘤。
新建立的杂交瘤细胞虽不能从内源性途径合成DNA，但由于具有正常脾 细胞提供的HGPRT，可以利用培养液中外源性的次黄嘌呤和胸腺嘧啶， 得以合成DNA和RNA，因而能生长繁殖，以大约24-48小时繁殖一代的 速度增殖，数量迅速超过残存的，不能分裂增殖的未融合的骨髓瘤细胞， 通常在融合后的2-4周内，即长成珍珠样的杂交瘤细胞，此时培养液中 可能有McAb存在。
基于上述情况，所用骨髓细胞是酶缺陷株，不能利用培养液中外源性的 嘌呤和嘧啶来合成组成自身核酸的嘌呤和嘧啶，而内源性核酸的合成途 径又被培养基中的氨基喋啶所阻断，因此未融合的骨髓瘤细胞便失去合 成自身必须的DNA和RNA的原材料，而不能分裂增殖，终将导致死亡。
至于未融合的脾细胞，HAT培养液虽不能将其清除，但由于脾细胞本身 不能在体外培养存活，在2周内必将自然死亡。
生产单克隆抗体的程序
亲本细胞的准备 1. 免疫小鼠制备脾细胞 BaLb/c小鼠、免疫2-3次、脾细胞浓度
约103/ml。 2. 骨髓瘤细胞 SP2/0细胞（4瓶）
选择培养基 HAT、HT
细胞融合 PEG（MW 1000-4000） 脾细胞: SP2/0细胞 —— 5:1 or 10:1
融合时间小于90秒
培养 融合2-4周形成集落、检测抗体、当杂交瘤到达每孔的1/5—1/2时进行筛
选。
克隆 常用有限稀释法，每孔稀释至1个细胞，进行3-5次克隆，可获得纯化的
McAb和杂交瘤。
生产 1. 小鼠腹腔生产：注入杂交瘤后约7-10天产生腹水，含量5-20mg/ml，
每只小鼠大约产10 ml腹水。 2. 细胞生产：含量约10ug/ml、效价低于腹水。 保存
核的异核体细胞，当细胞再次分裂时，核也分裂，而且两个分裂细胞核 的染色体又融合一起，存在一个细胞中，形成同核细胞，由此分裂下去， 即产生出杂交瘤细胞，但是杂交瘤细胞的形成率很低，约10-20万分之 一。因此，必须找到一种只有杂交瘤细胞能生长，骨髓瘤细胞不能生长 的方法，才能达到建立杂交瘤细胞的目的。
建立杂交瘤细胞必须具备的以下基本条件 1. 瘤细胞不分泌免疫球蛋白 2. 二是对8-氮鸟嘌呤（8-AG）有抗药性 3. 缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT） 4. 缺乏胸腺嘧啶核苷酸激酶的小鼠骨髓瘤变异株 5. 培养液（HAT）含有次黄嘌呤（H）、氨基喋啶（ A）和胸腺
嘧啶（T）核苷