北京大学生物化学课件19

2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而获 诺贝尔生理医学奖。
Leland H. Hartwell
R. Timothy (Tim) Hunt
Sir Paul M. Nurse
第二节 细胞周期调控的关键 分子
细胞增值调控与肿瘤的分子基础
刘新文
北京大学医学部生化与分子生物学系
第一节 细胞周期概述
“细胞周期”（cell cycle）又称“细胞分裂 周期”，是指一个细胞经生长、分裂形成两 个细胞所经历的全过程，即细胞从一次分裂 结束到下一次分裂结束所经历的全过程。
Interphase (Long) G1: Cell growth S: DNA replication G2: Cell growth
4、M期：Cyclin B和泛素(ubiquitin)被磷酸化。在特定 酶的作用下，磷酸化的Cyclin B泛素化，然后由依赖泛素 的蛋白水解酶催化降解，结果使Cdc2失去调节单位而失活， 细胞回到G1期。促后期复合物(APC)对M-Cyclin及分裂期 其他调控因子的泛素化和蛋白水解起重要作用。
3、G2期：Cyclin E降解，Cyclin B积累，并与 Cdc2(Cdk1)结合，形成促成熟因子(maturationpromoting factor，MPF)复合体，即M-CdkC。细胞中 的蛋白激酶将Cdc2的Tyr15和Thr14磷酸化，形成无活 性的前MPF (pre-MPF)。未磷酸化的活性MPF能激活磷 酸酶Cdc25，将Cdc2的Tyr15和Thr14去磷酸化，从而激 活更多的MPF(Cdc2的自催化过程)，促使染色体浓缩， 微管蛋白磷酸化，细胞骨架的重新组合，推动细胞分裂。
p21的功能
• 可能作用于细胞周期的多个环节。 • P21可与Cyclin、Cdk和增殖细胞核抗原(PCNA)组成四 聚体。其N端结构域与Cyclin-Cdk结合，抑制Cyclin-Cdk 磷酸化Rb蛋白，阻止细胞进入S期。 • 当细胞在S期发生DNA损伤时，p21的C末端结构域与 PCNA直接结合，抑制DNA聚合酶活性，阻止损伤 DNA长链的复制。但p21不能抑制DNA复制起始复合 物的形成和DNA缺口的修补，所以，DNA的修复不会 被抑制。 • p21基因的启动子区域含有p53蛋白的结合位点。
Cln 1、 CDK1(CDC28) 2 Clb 5、 CDK1(CDC28) 6 CDK1(CDC28)
CDK1(CDC2) Clb 1-4
• Cyclin D包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞 中的表达量不同，但具有相同的功效。
细胞周期中不同类型cyclin的表达变化
二、周期蛋白依赖性蛋白激酶
细胞周期调控的核心蛋白：
1.周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,Cdks)：细胞周期调节的中心环节
2.细胞周期蛋白(Cyclin) ：Cdk的正调节因子
3. Cdk抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)：Cdk的负调节因子
p21
• p21是第一个被发现的CKI基因(1993年)，其抑制作用最广 泛，对细胞周期各期的Cdks均有明显的抑制作用。由于其 表达蛋白质分子量为21 kD，而且最初认为它与野生型p53 的生物活性有关，故命名为p21WAF-1(Wild-type p53 Activated Fragment-1)；后又发现p21与细胞老化等多种因素有关，故 又称p21SDL1/Cip-1/CAP20/PIC1等。 第一个被发现的CKI基因 p21定位于6p21 抑制作用最广泛 表达蛋白质分子量为21 kD
Cyclins的水解
主要机制：泛素依赖的蛋白质水解 限速步骤：泛素连接酶催化的泛素转移反应。
关键酶： SCF(Skp1-Cdc53/cullin-F-box protein complex) 和APC (Anaphase-promoting complex，促后期复合物)， 泛素化并降解细胞周期调控蛋白。
哺乳 动物
Cdk4 Cdk5 Cdk6
Cdk7 Cdk8 Cdk9
Cyclin H Cyclin C Cyclin T
Cdk-activating kinase Transcription regulation G1/S
三、Cdk抑制蛋白(CKIs)
• Cdk抑制蛋白是Cdk的负调节因子，拮抗Cyclin的作 用，阻止细胞经过检验点 。 1、CKI两大家族
A
B(B1,B2) Cdk1（Cdc2） C
－ Cdk4（2，5，6）
Cdk2 － － Cdk7
－ G1
G0 G1 S － － G1,S,G2,M
－ p15, p16, p21, p27, p18, p19, p57
p21，p57 － － －
D(D1～ 3)
E F G H
p21 and p27 inhibit assembly and activity of cdk4,6cyclin D and cdk2-cyclin E by CAK. They also inhibit cycle progression independent of RB activity. p16 inhibits both assembly and activity of cdk4,6-cyclin D.
• 周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cdks)是一类Ser/Thr蛋白 激酶，在细胞周期的调节中起关键作用。人体细胞 内主要有Cdk1/Cdc2、Cdk2~6、Cdk7/CAK和Cdk8等。
1、结构特点：3个主要功能域
活性中心：ATP结合部位；催化部位 调节亚基Cyclin的结合部位：正调节 P13suc1的结合部位：负调节，阻止细胞进/退M期
Protein degradation is important in mitosis
细胞周期驱动的核心成分 是Cdks。Cyclin-Cdk复合 物活性的调控决定着细胞 周期的进程。
二、Cyclin-Cdk复合物的调节
结构调节：Cdk亚基的磷酸化、CKIs的结合。
数量调节：Cdk调控因子的转录调控；
Checkpoint
1. G1期（gap 1 phase）
2. S期（synthesis phase） 3. G2期（gap 2 phase）
Checkpoint
4. M期（mitosis phase） 5. G0期
M-phase= mitosis (Short) Chromosome segregation Cytokinesis
Cdc28
Cln1、Cln2、Cln3 Clb3、Clb4、Clb5、Clb6 Clb1、Clb2、Clb3、Clb4 Cyclin B Cyclin E1, E2 Cyclin A Cyclin E Cyclin D1、D2、D3 Cyclin D1、D3 Cyclin D1、D2、D3
Cdk1 Cdk2 Cdk3
N端含有一个与细胞周期蛋白盒N端同源的序列；还含 有4个锚蛋白重复序列。
可抑制Cdk4或Cdk6的活性，使其不能对Rb磷酸化。
Cyclins-Cdks-CKIs的相互作用关系
Cylcins
Cdk
Cdk1，Cdk2
细胞周期作用 S G2 M G2 M
相关CKIs
p21，p27，p57 p21，p57
p16
• p16又称MTS1基因（Multiple tumor suppressor 1），其编码 蛋白质的分子量约为16 kD，主要抑制Cdk4的活性，故命名 为p16INK4A。 p16基因定位于9p21-22
来自百度文库其编码序列由3个外显子组成
有α、β两个转录本。 表达蛋白质分子量为16 kD
Multiple levels of regulation provide input for “checkpoint control”
依赖Cyclin的蛋白激酶（Cdc/Cdk） 种属 裂殖 酵母 出芽 酵母
Cdk
Cdc2 CIG1 CIG2 Cdc13
Cyclin
细胞周期或功能
G1 S G2/M G1 S G2/M G2/M G1 S G1/S G1 Neuronal differentiation G1/S
CDK activating
3、组成、结构调节：活化与非活化Cdk的比例 正性调节：人Cdk与特定的Cyclin 结合才有活性； 也只有Cyclin降解才能使Cdk最终失活。 负性调节：CKI与Cdk结合后阻止Cdk磷酸化。 共价调节：抑制性位点磷酸化失活(Wee1激酶)； 去磷酸化复活(Cdc25磷酸酶)。 协调调节：人Cdc2的Thr 160/161和Thr 14/Tyr 15 磷酸化，可促进Cdk-Cyclin结合。 这种磷酸化又依 赖Cyclin，Cyclin与Cdk的结合可导致Cdk T环的移开， 暴露出其中的Thr 160/161位点 。
positive feedback loop Rb phosphorylation maintained until Cyclin B destruction
细胞周期的驱动
2、S期：Cyclin D降解，Cyclin E和A积累，先后与 Cdk2结合为Cyclin E-Cdk2复合物(又称G1/S-CdkC)及 Cyclin A-Cdk2复合物(又称S-CdkC)，维持DNA复制。
（1）CIP/KIP(Kinase inhibition protein)家族：广泛抑制 Cdk1-, Cdk2-, Cdk4/6-Cyclin复合物。因其N端和C端分别 具有不同的结构和功能，故又称双重特异家族。包括 p21、p27和p57 （2） INK4(Inhibitor of cdk4)家族：特异性抑制Cdk4/6D Cyclins，因其结构中含有数个具强烈疏水性的锚蛋白 （ankyrin）重复序列，故又称锚蛋白家族，包括p15、 p16、p18和p19。
一、细胞周期蛋白（Cyclins）
细胞周期蛋白（Cyclins）是一类伴随细胞周期的 不同阶段表达、累积和降解的蛋白质因子。 1、结构特点
细胞周期蛋白盒(Cyclin box): 与Cdk结合，激活Cdk 的蛋白激酶活性 毁灭盒(Destruction box): 在Cyclin的自身降解中发 挥重要作用
2、调控机理
Cyclin与Cdk形成二聚复合体：催化亚基为Cdk，调 节亚基为Cyclin。
Destruction Box in Cyclins
3、分类：A-H 不同类型的CDK/cyclin复合体
脊椎动物 激酶复合体 Cyclin G1-CDK G1/S-CDK S-CDK M-CDK Cyclin D* Cyclin E Cyclin A Cyclin B CDK CDK4 、6 CDK2 CDK2 Cyclin Cln 3 CDK CDK1(CDC28) 芽殖酵母
2、没有酶量的调节：在整个细胞周期中，某一Cdk的含
量恒定，其活化Cdk与非活化Cdk的总量不变。
CdK的结构
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ： 抑制性磷酸化位点； cyclin结合位点； ATP结合位点 Ⅵb: 催化部位 Ⅶ: ATP结合位点
Ⅷ: T-loop；活性磷 酸化位点
Ⅸ: 自身磷酸化位点
Cyclin A
Cdk2
M-phase promoting factor = MPF =cdk1/cyclinB
MPF activity controlled by: 1) cyclin B levels 2) phosphorylation of cdk1
CDK激酶(CDK activating kinase， CAK)：磷酸化Thr161 Wee1激酶：磷酸化Tyr15/Thr14
第三节 细胞周期的调节
一、细胞周期的驱动
1、 G1期：在生长因子诱导下，Cyclin D首先被合 成，于G1中期达到峰值，并与Cdk4、Cdk6结合形成 Cyclin D-Cdk4或Cyclin D-Cdk6复合物(又称G1CdkC)，激活Cdk4或Cdk6的蛋白激酶活性，使Rb蛋 白磷酸化。磷酸化的Rb蛋白与结合的E2F(无活性) 分离，释放出有活性的E2F，E2F作为转录因子激活 与DNA复制相关基因的表达，使细胞进入S期。