免疫荧光总结

⑴ 固定目的 • 防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落
• 去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质
• 易于保存
⑵ 常用的固定方法： 抗原 固定剂
蛋白质 Ig类 酶类 激素 类脂质 多糖(细菌) 95%乙醇 甲醇 丙酮 CCl4 10%福尔马林 10%福尔马林 丙酮、甲醇 无水乙醇 丙酮、CCl4
固定方法
室温3~10min或4℃30min 同上 同上 同上 室温3~10min 室温3~10min或4℃30min
3 荧光的产生：
物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态 时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光， 这种光称为荧光。这种物质称为荧光素
由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术
4 荧光素的荧光特性： ⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长<发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
病毒
室温5~10min或4℃30~60min 或-20 ℃60min以上
二、试验类型
1 2 3 4
直接法 间接法 补体结合法 双标记法
荧光 抗原 光源 标记 抗体
直接法原理示意图
荧光
抗原
抗体
标记 抗体 光源
间接法原理示意图
三、 方法 1. 在35mm培养皿中接种细胞，至生长旺盛时， 用甲醇直接固定5min 2. 加1ml PBST振荡洗涤3次，每次5min
6 合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团
荧光素-N=C +NH-蛋白质 ‖ ︱ S H 荧光素-N-C-N-蛋白质 ︱‖ ︱ H S H
⑵ ⑶ ⑷ ⑸ ⑹
荧光效率高，标记后下降不明显 荧光色泽与背景色泽对比鲜明 标记后能保持生物学活性和免疫活性 标记方法简单、快速 安全无毒
7 标本的固定：
免疫荧光技术
陈海蓉
一、一些基本概念和基本知识： 1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原 或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与 标本中相应的抗体或抗原反应后，测定 复合物中的荧光素，这种免疫技术，称 为免疫荧光素技术
2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
5 常见荧光素： ⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它
常见荧光素的特性：
⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光 ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光 ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光 ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色 荧光 ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质
四、 注意事项 1. 标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗 原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形 态；④固定后应保持细胞膜 的通透性，以允 许抗体进入与抗原结合
2. 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指 标判断结果，一个是形态学特征；另一个是 荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者 结合起来，综合判定
三、 方法 9. 小心切除培养皿侧边，注意其皿底的平整性， 再用PBST缓冲液轻轻冲洗一下以确信洗去滞 留在细胞面上的微小塑料屑，并于通风处晾 干
10. 滴加阻止荧光淬灭剂Vectashield滴，并覆以酒 精擦净晾干的盖玻片，遮光低温4℃保存
11. 于IX-70倒置荧光显微镜（奥林巴斯，日本）
下用1,000×油镜观察，同时也可应用激光共 聚焦显微镜进行观察并照相
3. 用1：100浓缩正常羊血清（2,000 ×g，离心 5min）封闭非特异性位点30min
4. 加1ml PBST振荡洗涤3次，每次5min
三、 方法 5. 滴加1：500 第一抗体5×10-4L（JWA多克隆 抗体和单克隆抗体，2,000 ×g ，离心5min）， 37℃于摇床湿盒中，孵育2h 6. 加1ml PBST振荡洗涤3次，每次5min 7. 滴加1：300 第二抗体5×10-4L（FITC标记羊 抗兔IgG和罗丹明标记的IgG (H+L)，2,000 ×g，离心5min）， 37℃于摇床湿盒中，孵育 1h 8. 加1ml PBST振荡洗涤3次，每次5min
四、 注意事项 3. 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相 对的，因此随着保存时间的延长，在各种条 件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其 应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带 来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之 后应立即观 察 4. 保存的方法可采取以下几种：①固定标本片 以后低温保存，随用随染；②染色片采取优 质封固剂