实时定量PCR技术总结

目标基因的序列或者基因号
引物扩增片段（扩增子）的长度 引物的Tm值（退火温度）
相应物种及对应的数据库
引物扩增特异性设置参数（重要）
点击获取引物序列
定量PCR引物的设计---扩增特异性的检测
琼脂糖凝胶电泳检测（通用）：
特异性扩增
借助溶解曲线判定（限于SYBR染料法）：
溶 解 曲 线
特异性扩增
重复孔之间Ct值的差值不应超过0.5 无模板阴性对照的扩增曲线理论上讲应该不起峰，但如果起 峰的话，应保证Ct无模板阴性对照-Ct正常样品>5
内容提纲

定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
常见问题---扩增曲线的初始扩增不规则
规则的初始扩增
不规则的初始扩增
原因：模板中存在抑制物
常见问题---扩增曲线无基线期
无基线期
有基线期
原因：初始模板量过多，导致样品过早扩增
常见问题---扩增曲线不平滑
曲线不平滑
原因： • 体系中抑制物较多，导致荧光不稳定 • 荧光染料或探针的品质不好 • 仪器使用过度，荧光收集不稳定 • 仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正)
- (Ct样品1- Ct样品2)= - ΔCt
(1+E)
- ΔCt
N0样品1/ N0样品2= (1+E)
=2
- ΔCt
（扩增效率E≈100%时）
2( -ΔCt)法相对定量： 无均一化处理 结果的准确性依赖于加样的一致性 研究基因表达时，依赖于加样总mRNA(cDNA)量的绝对一致性!
相对定量--- 2( -Δ ΔCt)法
• SYBR Green对DNA序列并无
特异性识别 • 非特异性扩增产物、引物二 聚体等也同样被标记 • 缺点：荧光信号容易被高估
延伸过程 染料结合
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
Taqman探针法
(1) Taqman探针是特异性荧光标记，识别特定 的DNA序列 (2) 一条探针，二条引物
定量PCR Taqman探针的设计
探针的特异性要高 探针的长度最好在25~32bp 探针的Tm值应比引物Tm高约10℃
确保在退火时探针先于引物与目的片段结合
探针的Tm值为68~72℃为宜 探针的GC含量控制在30%~70% 探针位置尽可能地靠近上游引物 探针的5'末端不是G
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
SYBR Green I染料法
SYBR Green I在PCR过程中的作用原理
• 扩增形成DNA双链的过程随
变性 时有染料结合，染料一旦结合 至双链DNA就产生荧光信号 退火 • 产生的荧光信号强度与体系 中DNA分子总数目成正比 • 优点：经济、方便 延伸
根据初始模板量N0与Ct值之间的线性方程： lgN0= - lg(1+E) ×Ct + lgM
lgN0样品1= - lg(1+E) ×Ct样品1 + lgM lgN0样品2= - lg(1+E) ×Ct样品2 + lgM (1) (2)
方程式(1)减去方程式(2)后，两边同时取底数得： N0样品1/ N0样品2=(1+E)
正向引物
引物位于探针结合的两端
反向引物
(3) 一条探针，二个基团
报告基团 淬灭基团 5’ 3’
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
Taqman探针的工作原理 (1)荧光共振能量转移(FRET)
Förster, Ann. Physik. 1948, 437, 55
(2)反应过程中Taq酶的5'→3'外切活性
标准 曲线
• 标准曲线r2:0.95~1 • E: 90%~110%
真实、准确的Ct值 可靠的实验结果
定量PCR结果各参数的一般标准
Ct值是实验结果准确与否的重要参考 Ct值的一般范围：
• 大多数情况下，定量PCR实验的Ct值最好在17~30之间，条件放宽 的话Ct值最低不应小于15 • 若Ct值在30~35之间，则需多次重复实验以判断数据的准确性 • 若Ct值大于35，则基本可以认为反应失败
(1)
因此，可以由扩增曲线得到引物扩增的线性函数曲线：
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
SYBR Green I染料法
(1) SYBR Green I染料结合DNA双链的小沟
(2) SYBR Green I是非特异性荧光标记
（该染料游离时不发荧光）
（该染料与双链DNA结合后发荧光）
定量PCR的化学原理----PCR产物的荧光标记
Taqman探针法在定量PCR中的工作原理
变性 退火 •每产生一条DNA链，就切 断一条探针；每切断一条 探针，就产生一个单位的 荧光信号 • 产生的荧光信号强度与 延伸 PCR产物分子总数目成正 比 • 优点：特异、准确 • 委托公司标记 延伸过程中 荧光报告基 团被释放 • 缺点：成本较高
非特异性扩增
定量PCR引物的设计---提高扩增效率
引物扩增效率的计算： 通过标准品获得如下标准曲线： lgN0= - lg(1+E) ×Ct + lgM 进而由该标准曲线的斜率(Slope)获得E，即： - log(1+E)=Slope E=10(-Slope)-1 较好的引物扩增效率的范围： 90% < E < 110%
为了校正加样总mRNA(cDNA)量的一致性，引入看家基因。
看家基因作为内参的选择标准： 在所待测样品中，看家基因的表达量都应该恒定不变 注意所选的看家基因是否存在可能的物种、组织、发育阶段、 处理方式依赖性等 使用多个看家基因对于准确地定量可能是有必要的 常用的看家基因(内参)包括β-actin、GAPDH、18s rRNA等
定量PCR引物的设计---提高扩增效率
引物结合的位置影响扩增效率
EprimerA = 66.3% EprimerB = 95.8%
尽量避免具有复杂二级结构的扩增子
不利于引物延伸 有利于引物延伸
二级结构预测网站Mflod： http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold
内容提纲

定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
定量PCR结果各参数的一般标准
判断数据的有效性
正常扩增
扩增特异性
（限SYBR染料法）
扩增效率
扩增 曲线
• S型扩增曲线 • 扩增曲线平滑 • 重复性较好
溶解 曲线
• 溶解曲线呈现单峰 • 峰宽度较小 •或借助电泳检测
常见问题---扩增曲线的重复性差
重复性较好 重复性较差
原因： • 加样误差，体系配置错误，反应液没有混匀 • 低拷贝基因或初始模板浓度过高或过低 • 未引入校正系统
常见问题---扩增效率
理想的扩增效率应当是接近100% 问题1：扩增效率小于90% • 引物本身即存在问题 • 反应体系存在问题，需进一步优化 问题2：扩增效率大于100% • 标准曲线制作时稀释样品加样错误 • 反应中有非特异性产物生成 • 模板中存在反应抑制剂(如右图蓝线)
标准品：
标准品
未知样品
标准品的制备
可用做标准品的模板DNA包括：
含有目标基因的质粒 纯化后的PCR产物 合成的寡核苷酸
每管依次各取10 μl至下一管
系列稀释
每管事先分别装有90 μl的ddH2O
标准品至少包括5个不同的浓度 未知样品的浓度应当位于标准品的浓度范围内
相对定量--- 2( - ΔCt)法
平台期
线性增长期 荧光阈值 (threshold) 指数增长期 基线期
Ct (Cycle threshold)
根据Ct值进行起始定量的数学原理
PCR理论方程：
荧光阈值线
Ct
在扩增产物达到荧光阈值时: NCt=N0×(1+e)Ct=M
NCt:荧光信号达到荧光阈值时扩增产物的量，阈值线设定后,它是一个常数,我们将其设为M。
根据Ct值进行起始定量的数学原理
NCt=N0×(1+e)Ct=M 方程式(1)两边同时取对数得: lgN0 + log(1+e)Ct=lgM 整理方程式(2)得线性方程: lgN0= - lg(1+e) ×Ct + lgM (3) (2)
M: 荧光阈值（常数） e: 扩增效率（常数） N0: 起始模板量 Ct: 达到荧光阈值所需循环数
G容易淬灭报告基团发出的荧光信号，导致假阴性
避免探针存在复杂二级结构 避免探针与引物形成二聚体
实验操作的控制
相同的试剂，不同人操作
重复性较好
重复性较差
实验操作的控制
实验环境: 实验室环境和相关仪器保持干净 电泳区域与样品制备区要保持一定距离，避免交叉污染 使用经过校准的PCR专用加样器 使用PCR级的水（超纯水） 人为操作: 除模板外其它成分预混，充分混匀 反应体系中模板尽可能使用较大的加样体积（≥5μl），以减小 加样误差 保持定量PCR反应管外表面的的洁净 上机前确保PCR反应液中无气泡
累积实时监测整个PCR进程，通过Ct值和标准曲线对起始模板进 行定量分析。
终点产物的量 具有较大差异
扩增拐点处(Ct)则极具重现性
定量PCR如何做到起始定量
• PCR扩增曲线: 4个阶段 • 荧光阈值: 扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准 • Ct值: 扩增产物荧光强度达到荧光阈值时所需循环数
定量PCR引物的设计
好的定量PCR引物的标准： 具有较好的扩增特异性，无非特异性扩增 具有较高的扩增效率
获得准确、可重复的结果
定量PCR引物的设计---提高扩增特异性
Primer-BLAST在线设计: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
- ΔCt 目标基因
(1) (2)
(3)
（校正前）
Hale Waihona Puke Baidu
- ΔCt 看家基因
(4)
引入看家基因(内参)校正，(3)/(4)得：
N0目标基因,样品1/ N0目标基因,样品2= 2
（Δ ΔCt= ΔCt目标基因-ΔCt看家基因）
- Δ ΔCt
（校正后）
SYBR染料法 Vs Taqman探针法
医疗检验 TaqMan探针法 （准确度高） 科研 SYBR染料法 （成本较低） TaqMan探针法 （要求严格的定量）
变化倍数
相对定量
绝对定量：用于确定未知样本中目标核酸（初始模板）的绝对量 值，即通常所说的拷贝数 相对定量：用于测定目标核酸（初始模板）在测试样本中与校正 样本中数量的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或 者是在一个时程研究中处于零时的样本。
拷贝数
绝对定量---标准曲线法
系列稀释获得已知浓度的标准品，以标准品为模板扩增获得 “初始模板量关于Ct值的标准曲线” 借助标准曲线由未知样品的Ct值得出初始量，完成对未知样 品的绝对定量
相对定量--- 2( -Δ ΔCt)法
根据初始模板量N0与Ct值之间的线性方程： lgN0= - lg(1+E) ×Ct + lgM lgN0目标基因,样品1= - lg(1+E目标基因) ×Ct目标基因,样品1 + lgM lgN0目标基因,样品2= - lg(1+E目标基因) ×Ct目标基因,样品2 + lgM (1)-(2)，两边取底数： N0目标基因,样品1/ N0目标基因,样品2= 2 同理， N0看家基因,样品1/ N0看家基因,样品2= 2
定量PCR技术总结
Xiangbin CHEN
定量PCR的用途

临床疾病诊断
传染病诊断和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测；遗传病诊断
动物疾病检测
检测病毒病 （如猪流感病毒等）、细菌病（如肠炎沙门氏菌等）、 寄生虫病（如牛羊线虫等）
食品安全
检测食源微生物、过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌
内容提纲

定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
定量PCR的实验设计
绝对定量Vs相对定量 标准品的选择 看家基因（内参）的选择 SYBR染料法Vs Taqman探针法 引物或探针的设计 实验操作及条件的控制
绝对定量 Vs 相对定量
绝对定量
科学研究
医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究
内容提纲

定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
内容提纲

定量PCR的原理 实验操作方法 各参数的一般标准 常见问题及分析
终点定量和起点定量
常规PCR技术：对扩增反应的终点产物进行定性或定量分析。 定量PCR技术：在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号