表观遗传学测序--20140406
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5. 为进一步研究表观遗传学修饰 与人类疾病和发育的关系奠定 基础。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Thank you！
谢 谢
1
27
HRM(高分辨率熔解曲线) 荧光定量法（Methylight）：TaqMan 探针和PCR引物
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）
焦磷酸测序（Pyrosequencing） 。。。。。。
全基因组甲基化研究方法
BS-seq RRBS
全基因组甲基化研究方法
MeDIP-seq MBD-seq
---
分辨率
高，可以精确得到单 个碱基
获得Promoter和CpG 岛区域的单碱基精度 的甲基化图谱
最优适用
不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究 4 Gb（小基因组） 8 Gb（人）
5 µg
数据量
4 Gb（小基因组） 8 Gb（人）
5 µg
4G
样本量
3 µg
甲基化研究方法比较
MeDIP-seq MBD-seq 基于甲基-CpG结合结 构域 BS-seq 基于重亚硫酸盐转换 法 金标准 结合对象 单链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 双链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究，可区分不同 程度的甲基化 4 Gb（小基因组） 8 Gb（人） 5 µg 高，可以精确得到单 个碱基 获得单碱基精度的甲 基化图谱
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
mCG占99.98% in IMR90； 在两类细胞中mCG位点数量相当； 具有丰富的mCHG和mCHH in H1 。
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
non-CG methylation 在胚胎干细胞普遍存在，
甲基化研究方法比较
MeDIP-seq MBD-seq 基于甲基-CpG结合结 构域 RRBS 基于限制性内切酶和 重亚硫酸盐转换法
原理 灵敏度
结合对象
基于5mC特异性抗体 相对较低
单链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点
较高
双链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究，可区分不同 程度的甲基化
表观遗传学
DNA序列无变化， 基因表达发生改变 基因型未发生变化，
表型发生改变 改变可遗传并且可逆
2
表观遗传学研究内容
1、基因选择性转录表达的调控 DNA甲基化
染色质重塑
2、基因转录后的调控
非编码RNA调控
3、蛋白质的翻译后修饰
组蛋白修饰
3
ChIP-seq 甲基化测序
4
ChIP-seq
2样本：胚胎干细胞H1和肺部纤维原细胞IMR90，两个生物学重复 BS-Seq，87.5-91 Gb；mRNA-Seq； smRNA-Seq；ChIP-Seq Illumina GAII
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
基因组覆盖度：86%； 覆盖94% C； 62M（5.83%）/45M （4.25%） 5mC in H1 and IMR90 cells
案例：疾病机理研究
案例：疾病机理研究
结论：1、了解非小细胞肺癌全基因组甲基化情况； 2、鉴定了存在于所有NSCLC肿瘤组织中的57个差异甲基化区域，同时鉴定了两个 主要亚型所特有的DMRs；
3、获得了新的甲基化差异区域及相关基因，有利于疾病诊断和生物标记物的开发。
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
组蛋白修饰研究（H3K4M3、H3K36M3）
核小体定位研究（全基因组核小体定位图谱）
DNA甲基化研究（MeDIP-seq）
高级染色体结构研究（端粒）
7
ChIP-seq DNA甲基化测序
8
DNA甲基化测序
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的作用下，将 S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）上的甲基共价结合到 DNA 分子胞嘧啶 C5 位，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）的生化过程。 DNA甲基化测序是利用高通量测序技术和生物信息分析手段研究全 基因组水平上的胞嘧啶甲基化状态，获得高分辨率的DNA甲基化图 谱，从而为疾病发生、治疗相关的研究提供研究基础。
高通量测序技术的应用
---甲基化测序
李海燕 lihy@
上海派森诺生物科技有限公司
表观遗传学
1942年，沃丁顿（waddingtong）在研究细胞发展命运时，第一次提出表观 遗传学概念。在研究与经典孟德尔遗传法则不相符的生命现象过程中逐渐发展 起来，并成为后基因组时代的重要研究领域。
原理 灵敏度
基于5mC特异性抗体 相对较低
较高
分辨率
最优适用
不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究
4 Gb（小基因组） 8 Gb（人） 5 µg
数据量
>10× 2 Gb（微生物） ≥10 µg
样本量
案例：疾病机理研究
14个样本：7个患者，三种亚型（ADC3腺癌 /SCC3鳞状细胞癌/LCC1大细胞癌）； 4个对照：2个阴性，2个阳性 Illumina GAII，>30 M reads
研究领域
基础研究
癌症 ：甲基化失衡，肿瘤生物标志物（特定基因甲基化）
发育生物学 ：动物胚胎发育、植物抗逆研究 干细胞分化
医药
ＤＮＡ甲基转移酶抑制剂
临床诊断检测
肿瘤早期检测 肿瘤分类、分级
特异甲基化位点检测
甲基化特异性PCR（MSP）:两对引物
BSP（亚硫酸氢盐PCR测序）
具有特异的甲基化模式
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
结论 1. 绘制了胚胎干细胞和肺部纤维 原细胞表观基因组图谱； 2. 胚胎干细胞具有特异调控基因
表达的甲基化机制； 3. non-CG methylation模式在基 因区域富集，在蛋白质结合位 点和增强子区域缺乏； 4. 坚定了大量的甲基化差异区域 及相关功能基因；
染色质免疫共沉淀技术是研究体内 蛋白质与DNA 相互作用的有力工 具，通常用于转录因子结合位点或 组蛋白特异性修饰位点的研究。将 ChIP 与第二代测序技术相结合的 ChIP-Seq 技术，能够高效地检测全 基因组范围内与组蛋白、转录因子 等互作的DNA区段。
5
分析流程
6
ChIP-seq应用
转录因子结合位点研究（启动子、增强子）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Thank you！
谢 谢
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HRM(高分辨率熔解曲线) 荧光定量法（Methylight）：TaqMan 探针和PCR引物
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）
焦磷酸测序（Pyrosequencing） 。。。。。。
全基因组甲基化研究方法
BS-seq RRBS
全基因组甲基化研究方法
MeDIP-seq MBD-seq
---
分辨率
高，可以精确得到单 个碱基
获得Promoter和CpG 岛区域的单碱基精度 的甲基化图谱
最优适用
不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究 4 Gb（小基因组） 8 Gb（人）
5 µg
数据量
4 Gb（小基因组） 8 Gb（人）
5 µg
4G
样本量
3 µg
甲基化研究方法比较
MeDIP-seq MBD-seq 基于甲基-CpG结合结 构域 BS-seq 基于重亚硫酸盐转换 法 金标准 结合对象 单链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 双链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究，可区分不同 程度的甲基化 4 Gb（小基因组） 8 Gb（人） 5 µg 高，可以精确得到单 个碱基 获得单碱基精度的甲 基化图谱
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
mCG占99.98% in IMR90； 在两类细胞中mCG位点数量相当； 具有丰富的mCHG和mCHH in H1 。
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
non-CG methylation 在胚胎干细胞普遍存在，
甲基化研究方法比较
MeDIP-seq MBD-seq 基于甲基-CpG结合结 构域 RRBS 基于限制性内切酶和 重亚硫酸盐转换法
原理 灵敏度
结合对象
基于5mC特异性抗体 相对较低
单链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点
较高
双链DNA 相对较低，只能检测 甲基化区域，不能精 确到甲基化位点 不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究，可区分不同 程度的甲基化
表观遗传学
DNA序列无变化， 基因表达发生改变 基因型未发生变化，
表型发生改变 改变可遗传并且可逆
2
表观遗传学研究内容
1、基因选择性转录表达的调控 DNA甲基化
染色质重塑
2、基因转录后的调控
非编码RNA调控
3、蛋白质的翻译后修饰
组蛋白修饰
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ChIP-seq 甲基化测序
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ChIP-seq
2样本：胚胎干细胞H1和肺部纤维原细胞IMR90，两个生物学重复 BS-Seq，87.5-91 Gb；mRNA-Seq； smRNA-Seq；ChIP-Seq Illumina GAII
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
基因组覆盖度：86%； 覆盖94% C； 62M（5.83%）/45M （4.25%） 5mC in H1 and IMR90 cells
案例：疾病机理研究
案例：疾病机理研究
结论：1、了解非小细胞肺癌全基因组甲基化情况； 2、鉴定了存在于所有NSCLC肿瘤组织中的57个差异甲基化区域，同时鉴定了两个 主要亚型所特有的DMRs；
3、获得了新的甲基化差异区域及相关基因，有利于疾病诊断和生物标记物的开发。
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
组蛋白修饰研究（H3K4M3、H3K36M3）
核小体定位研究（全基因组核小体定位图谱）
DNA甲基化研究（MeDIP-seq）
高级染色体结构研究（端粒）
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ChIP-seq DNA甲基化测序
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DNA甲基化测序
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的作用下，将 S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）上的甲基共价结合到 DNA 分子胞嘧啶 C5 位，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）的生化过程。 DNA甲基化测序是利用高通量测序技术和生物信息分析手段研究全 基因组水平上的胞嘧啶甲基化状态，获得高分辨率的DNA甲基化图 谱，从而为疾病发生、治疗相关的研究提供研究基础。
高通量测序技术的应用
---甲基化测序
李海燕 lihy@
上海派森诺生物科技有限公司
表观遗传学
1942年，沃丁顿（waddingtong）在研究细胞发展命运时，第一次提出表观 遗传学概念。在研究与经典孟德尔遗传法则不相符的生命现象过程中逐渐发展 起来，并成为后基因组时代的重要研究领域。
原理 灵敏度
基于5mC特异性抗体 相对较低
较高
分辨率
最优适用
不同样本之间的比较 尤其是大样本量的比 较研究
4 Gb（小基因组） 8 Gb（人） 5 µg
数据量
>10× 2 Gb（微生物） ≥10 µg
样本量
案例：疾病机理研究
14个样本：7个患者，三种亚型（ADC3腺癌 /SCC3鳞状细胞癌/LCC1大细胞癌）； 4个对照：2个阴性，2个阳性 Illumina GAII，>30 M reads
研究领域
基础研究
癌症 ：甲基化失衡，肿瘤生物标志物（特定基因甲基化）
发育生物学 ：动物胚胎发育、植物抗逆研究 干细胞分化
医药
ＤＮＡ甲基转移酶抑制剂
临床诊断检测
肿瘤早期检测 肿瘤分类、分级
特异甲基化位点检测
甲基化特异性PCR（MSP）:两对引物
BSP（亚硫酸氢盐PCR测序）
具有特异的甲基化模式
案例：首 张 人 类 表 观 基 因 组 图 谱
结论 1. 绘制了胚胎干细胞和肺部纤维 原细胞表观基因组图谱； 2. 胚胎干细胞具有特异调控基因
表达的甲基化机制； 3. non-CG methylation模式在基 因区域富集，在蛋白质结合位 点和增强子区域缺乏； 4. 坚定了大量的甲基化差异区域 及相关功能基因；
染色质免疫共沉淀技术是研究体内 蛋白质与DNA 相互作用的有力工 具，通常用于转录因子结合位点或 组蛋白特异性修饰位点的研究。将 ChIP 与第二代测序技术相结合的 ChIP-Seq 技术，能够高效地检测全 基因组范围内与组蛋白、转录因子 等互作的DNA区段。
5
分析流程
6
ChIP-seq应用
转录因子结合位点研究（启动子、增强子）