常用染色方法
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瑞氏染色法
二、细胞着色原理: 既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用。各种细胞 成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。如血 红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结合 ,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白、淋巴细胞、 嗜碱性粒细胞胞质为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合, 染紫蓝色或蓝色,称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态 与伊红和美蓝均可结合,染淡紫红色,称为嗜中性物质、 原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质,染 成较浓厚的蓝色;中幼红细胞既含酸性物质,又含碱性物 质,染成红蓝色或灰红色;完全成熟红细胞,酸性物质彻 底消失后,染成粉红色。
常用的染色方法
王萍
主要内容
瑞氏染色法
网织红细胞染色方法 革兰染色法 抗酸染色法
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瑞氏染色法
一、概述: 瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料 由酸性伊红和碱性美蓝组成,美蓝和伊红的水溶液混合后 ,产生一种不溶于水的伊红化美蓝中性沉淀(ME),即 瑞氏染料。将适量的ME溶解于甲醇中,即成为瑞氏染液 。
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瑞氏染色法
5、染色过淡,可以复染。复染时应先加缓冲液,创造 良好的染色环境,而后加染液,或加染液与缓冲液的混合 液,不可先加染液。 6、染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间,也可用 甲醇脱色。 7、染色偏酸或偏碱时,均应更换缓冲液再重染。 8、瑞氏染液的质量好坏除了用血涂片实际染色效果评 价外,还可采用吸光度比值RA评价。瑞氏染液的成熟指数 以RA(A650nm/A525nm)=1.3±0.1为宜。
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网织红细胞染色方法
三、注意事项: 1、活体染色时间不能过短。室温低时,放37℃恒温箱。 2、最好制两张片,每张计数1000个红细胞,避免分布不 均引起的误差,涂片要薄而均匀,不使红细胞重叠。 3、为计数方便,可于目镜中放一中间有孔硬纸片或用 Miller窥盘,缩小视野便于计数。 4、用瑞氏或瑞氏-吉姆萨染液复染后,可使网织红细胞计 数结果减少。 5、染液与血液比约为1:1,严重贫血时可适量增加血液 的比例。
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瑞氏染色法
三、操作: 1. 制作血液或脱落细胞涂片,自然干燥固定; 2. 用蜡笔在血膜两头划线,滴加瑞氏染液3~5滴以覆盖 整个血膜,固定1~2分钟;滴加等量或稍多的缓冲液(未 加缓冲液涂片上有染料颗粒残留),吸球吹匀或摇动玻片 染色5~10分钟; 3. 用流动水从玻片的一侧冲去染液,自然干燥(或滤纸吸 干); 4. 镜检。
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中性杆状核粒细胞
中性分叶核粒细胞
嗜酸性粒细胞
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嗜碱性粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
网织红细胞染色方法
一、概述: 根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型: 花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经 体外活体染色后,显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或 具有线网状结构的无核红细胞,即为网织红细胞。WHO 推荐使用新亚甲蓝染色液,因其对网织红细胞染色力强且 稳定而被首推。
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抗酸染色法
二、方法: 1、涂片经火焰固定后,加石炭酸复红溶液2-3滴,徐徐 加热至有蒸汽出现,切不可沸腾。染5min,冷却后水洗。 2、加脱色剂(3%盐酸酒精)30s-1min,不时摇动玻片 至红色脱落为止,水洗。 3、加复染液(碱性美兰溶液),染0.5-1min,水洗。 4、干后镜检。
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G-菌
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G+菌
抗酸染色法
一、基本原理: 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质,主要是分枝菌 酸,它包围在肽聚糖的外面,所以分枝杆菌一般不易着色 ,要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌 中的分枝菌酸与染料结合后,就很难被酸性脱色剂脱色, 故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭 酸复红牢固结合成复合物,用盐酸酒精处理也不脱色。当 再加碱性美兰复染后,分枝杆菌仍然为红色,而其他细菌 及背景中的物质为兰色。
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革兰染色法
二、方法: 涂片→干燥→固定→染色过程如下: 1、涂片经火焰固定后,加结晶紫液染1min,清水冲去 染液,倒去玻片上水。 2、加碘液染1min,水洗。 3、加脱色液(95%乙醇),不使摇动10-30s,至无紫 色脱落为止,水洗。 4、加复染液(碱性复红液),染30s,水洗。 5、干后镜检。
抗酸染色法
三、注意事项: 1、抗酸染色直接用于痰标本时,可以适当增加标本涂片 的厚度,以提高检出率。 2、涂片厚度要适中。 3、初染加热的温度,勿沸腾。
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谢谢
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5பைடு நூலகம்
瑞氏染色法
四、注意事项: 1、PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为 两性电解质,所带电荷随溶液PH值而定。在酸性环境中正 电荷增多,已与酸性伊红结合,染色偏红;相反,则易与 美蓝结合,染色偏蓝。因此,应使用清洁中性的载玻片, 稀释染液必须用PH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。 2、染色的时间与染液浓度、染色时温度成反比;而与细 胞数量成正比。 3、冲洗时不能先倒掉染液,应用流水冲去,以防染料沉 淀在血膜上。 4、如血膜上有染料颗粒沉积,可加少许甲醇溶解,但需 立即用水冲掉甲醇,以免脱色。
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Miller窥盘法
由于目测计数误差较大,用Miller 窥盘法可减低标准误,特别是 RBC较少时. 盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上 划出格子:大方格内Ret/(小方格 内RBCx9)X100%
网织红细胞
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革兰染色法
一、基本原理: 革兰染色是细菌最基本的染色法,可用于标本涂片或 菌落涂片。细菌的等电点较低,约在PH2-5,一般情况下 细菌带负电荷,易于被带正电荷的碱性染料(结晶紫,碱 性复红)着色。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和 革兰阴性(红色)两类。
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革兰染色法
三、注意事项: 1、涂片:菌液涂片时,用接种环蘸取菌液直接在玻片 上涂布;若是菌落,先取生理盐水1滴,置于玻片上,用 接种针挑取菌落,在盐水中涂布。 2、干燥:制备的涂片应自然干燥。 3、固定:多采用加热固定,目的在于保持细胞原有的 形态和结构,杀死细菌,使染料易于着色,并是细菌附着 于玻片上不易脱落。自然冷却后在染色。 4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度, 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌;如 脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性 菌。因此必须严格把握脱色时间。
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网织红细胞染色方法
二、操作: 1、取小试管一支,加入新亚甲蓝染液2滴。 2、加入末梢血或EDTA抗凝静脉血2滴于上述试管中, 混匀。 3、室温下放置15min后,取1滴制成薄片。 4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数量。 5、计算: 网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞 数/1000; 网织红细胞绝对数(个/L)=网织红细胞百分数*红细胞 数/L