6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、苹果酸酶(ME)两种酶酶活测定方法
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6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、苹果酸酶(ME)两种酶酶活测
定方法
(1)6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活力测定
6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活力测定方法根据文献略有改动6979。测定反应体系(5ml)为：0.1mI浓度为1M的Tris-HCl缓冲液、0.1ml 浓度为25mM的底物G-6-P溶液、0.1ml浓度为2mM的NADP+、0.1ml 浓度为0. 2 M的氯化镁溶液及2.5ml ddH20，混合均匀后，在340 nm 下测定吸光度值A0，作为空白值。再加入0.1 ml粗酶液，摇匀后，与25℃条件下保温，每30S于340 nm下测定吸光度值A，连续测定4 min。以A对时间作图，取反应最初线性部分计算△A值。根据公式计算酶活力。
酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，每分钟G6PDH催化生成1μmol NADH的酶量为一个单位。
式中：△A/min为340 nm处每分钟吸光度的变化值；V为酶促反应体积(mL)；为NADH的摩尔消光系数(6.22×103L／mol·cm-1)；b 为比色皿光程(cm)。
(2)苹果酸酶(ME)活力测定
测定反应体系(3ml)为：0.5 mI浓度为0.4 M的Tris-HCl缓冲液、0.1 ml 浓度为30 mM的底物苹果酸溶液、0.2ml浓度为3.4 mM的NADP+、0.1ml浓度为0.12 M的氯化镁溶液及2 ml ddH20，混合均匀后，在340 nm下测定吸光度值A0，作为空白值。再加入0.1 ml粗酶液，摇
匀后，与250C条件下保温，每30s于340 nm下测定吸光度值A，连续测定4 min。以A对时间作图，取反应最初线性部分计算△A值。根据公式2-1计算酶活力。
酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，每分钟ME催化生成1μmol NADH的酶量为一个单位。