[课件]植物抗病基因工程的基本原理与方法PPT
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Байду номын сангаас
加入翻译起始密码子
由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是AUG， 因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的 核苷酸序列。 加入终止密码子 植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有 UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的 编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用 的是Ti质粒中的Nos终止子。 加入增强序列
植物抗病基因工程 的基本原理与方法
1 植物抗病基因工程策略
1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因
在植物抗性基因的利用方面
◆ 根据已有的R基因结构特征，设计新的R基因。 ◆ 异源表达R基因。 ◆ 向同一株植物中导入多个R基因。 在病原菌无毒基因的利用方面
◇ 转病原菌无毒基因。
◇ 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。 ◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。
转座子标签法
目的形状突变株
图位克隆法
构建核DNA文库
基因挽救技术 基因组相减法 cDNA差式显示
用转座子序列作 探针进行杂交
构建 核DNA 文库
分析转座子两侧序 列并以此作探针
完整的目的 转座子标签法流程图 性状基因
2.2 表达载体的构建
◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于
植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。
常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus
2.3 目的基因向植物的转化
◆ 近年来，植物的遗传转化技术得到了迅
速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆
菌Ti质粒及Ri质粒为载体的转化系统，以PEG
介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、
花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系 统可分为两大类：以载体为介导的基因转化
病害的抗性。
◆ 黄大年,等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入 水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻 白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻 白叶枯病的高抗品系。
2 植物抗病基因工程的技术环节 ◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的
基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中
1.4 导入其它蛋白基因
◆ 贾士荣,等(1993)和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯
导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。
◆ J.M.Jaynes(1993),et al.将cecropinB基因导入烟草 后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起
蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因
中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。
2.1 目的基因的分离和鉴定
◆ 对已知序列进行分子克隆
PCR扩增
◆ 从蛋白质到基因序列
构建cDNA文库
构建基因组文库
◆ 与已知基因紧密连锁基因的分离
◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离
转座子导入细胞 野生型 细胞核 DNA
1.2 导入植物防卫基因
◆ Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将 CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。
◆ M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆 的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草 中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。
◆ 美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化 酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具 有良好抗性的植株。
1.3 导入降解病原物致病因子基因
◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（tabtoxin）
的基因ttr，将基因ttr与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。
◆ 菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒 素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过argK基因 合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒 素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因 烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。
（vector mediated gene transfer）和DNA直接
转化（naked DNA transfer）。
2.4 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定
加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要 有3类：第一类是从Ti质粒的T-DNA序列上分离的启动 区。具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和CAT盒； 第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物 本身分离出来的启动子。
加入转录的加尾序列
真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 用的加尾序列是AATAAA。
加入与植物中特定DNA同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因 工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的 DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方 面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同
源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达
时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。 加入报道基因
插入内含子
内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因 工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这 种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人 推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。
加入翻译起始密码子
由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是AUG， 因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的 核苷酸序列。 加入终止密码子 植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有 UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的 编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用 的是Ti质粒中的Nos终止子。 加入增强序列
植物抗病基因工程 的基本原理与方法
1 植物抗病基因工程策略
1.1 导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因
在植物抗性基因的利用方面
◆ 根据已有的R基因结构特征，设计新的R基因。 ◆ 异源表达R基因。 ◆ 向同一株植物中导入多个R基因。 在病原菌无毒基因的利用方面
◇ 转病原菌无毒基因。
◇ 将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。 ◇ 导入与植物抗病信号有关的基因。
转座子标签法
目的形状突变株
图位克隆法
构建核DNA文库
基因挽救技术 基因组相减法 cDNA差式显示
用转座子序列作 探针进行杂交
构建 核DNA 文库
分析转座子两侧序 列并以此作探针
完整的目的 转座子标签法流程图 性状基因
2.2 表达载体的构建
◆ 目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于
植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’ 端加上启动子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源 基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。
常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus
2.3 目的基因向植物的转化
◆ 近年来，植物的遗传转化技术得到了迅
速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆
菌Ti质粒及Ri质粒为载体的转化系统，以PEG
介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、
花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系 统可分为两大类：以载体为介导的基因转化
病害的抗性。
◆ 黄大年,等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入 水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻 白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻 白叶枯病的高抗品系。
2 植物抗病基因工程的技术环节 ◆ 至今已分离的供植物基因工程应用的目的
基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、 细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的 基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干 旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中
1.4 导入其它蛋白基因
◆ 贾士荣,等(1993)和M.Hassan (1993),et al.向马铃薯
导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。
◆ J.M.Jaynes(1993),et al.将cecropinB基因导入烟草 后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起
蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因
中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有 少数是人工合成的。
2.1 目的基因的分离和鉴定
◆ 对已知序列进行分子克隆
PCR扩增
◆ 从蛋白质到基因序列
构建cDNA文库
构建基因组文库
◆ 与已知基因紧密连锁基因的分离
◆ 根据植株或细胞表型变异进行基因分离
转座子导入细胞 野生型 细胞核 DNA
1.2 导入植物防卫基因
◆ Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆几丁质基因的基础上将 CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶 高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。
◆ M.J.Carmona(1993),et al.，将来源于大麦基因组克隆 的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草 中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。
◆ 美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化 酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具 有良好抗性的植株。
1.3 导入降解病原物致病因子基因
◆ H. Anzai(1989),et al.分离到了抗烟毒素（tabtoxin）
的基因ttr，将基因ttr与CaMV 35S启动子融合成嵌合基 因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达 量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良 好的抗性。
◆ 菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒 素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过argK基因 合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒 素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因 烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。
（vector mediated gene transfer）和DNA直接
转化（naked DNA transfer）。
2.4 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定
加入启动子区 目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要 有3类：第一类是从Ti质粒的T-DNA序列上分离的启动 区。具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和CAT盒； 第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物 本身分离出来的启动子。
加入转录的加尾序列
真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有 一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一 方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常 用的加尾序列是AATAAA。
加入与植物中特定DNA同源的序列 为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因 工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的 DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方 面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同
源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达
时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。 加入报道基因
插入内含子
内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因 工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到 有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。 但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这 种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人 推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。