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❖ 肺转移及淋巴转移的样本将冻存到液氮或者用10% 福尔马林固定；这些组织将进一步用免疫组织化 学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN的表达 变化。
（三）、研究机制
研究证实，PDPN 3’-UTR区存在有一个保守位 点及两个非保守位点，而miR-363能够直接结合并 作用于此靶向调控位点，反向调节PDPN的表达， 并且呈剂量相关性，从而抑制了肿瘤细胞的转移及 侵袭能力。本实验利用荧光分子探针示踪方法，观 察比较裸鼠肺内及腘窝淋巴结肿瘤转移情况，用免 疫组织化学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN 的表达变化，用体内实验的方法来证明miR-363PDPN通路对肿瘤转移的调控作用。
.Байду номын сангаас
4
❖ 3. 目前有研究已经通过双荧光素酶报告分析系
统、 Transwell及wound-healing等实验，证实了体 外头颈鳞癌细胞系中，miR-363可以通过调控 PDPN的表达从而对肿瘤细胞侵袭、转移能力产生 影响。并对临床病例中转移 （0.99 ± 0.14）与未 转移（1.93±0.21）头颈鳞癌组织中miR-363的表 达水平有显著性差异(P = 0.001) (9)
.
9
2、荧光分子探针示踪，观察肿瘤转移情况
❖ 分别在14d、21d、28d、35d和42d使用IVIS-100 CCD camera(Xenogen)观察肺部肿瘤转移灶的数量和大小， 并通过Xenogen自带软件分别测量处理组以及对照组 裸鼠肿瘤灶及转移淋巴结的体积。
3、分析评价miR-363-PDPN通路对肿瘤转移的调控作用
动物体内观察miR-363对口腔鳞癌侵袭与转移的影 响及可能的调控机制
导师： 学生：
1 实验背景及意义 2 实验内容、方法及研究机制 3 技术路线以及实验难点 4 实验进度安排
5 参考文献
一、研究背景及意义
（一）研究背景
❖ 1. microRNA是一大类非编码小RNA，本身并不
编码蛋白质, 但是可以通过靶向、特异性作用mRNA 或基因启动子，导致靶mRNA降解或者抑制其翻译， 降低相关靶基因蛋白质的表达，从而发挥重要的调 控作用 [1]。目前研究已经证实，microRNA的异常 表达与疾病尤其是癌症有着密切的关系[2]。近年来 其作用及调控机制已成为国内外研究的热点，发现 microRNA在不同类型肿瘤及肿瘤的不同发展阶段 有着不同的表达[3]，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、 侵袭、转移及血管形成等过程[4]。
2014.8——免疫组织化学技术检测各种分子， 包 括miR-363及PDPN的表达变化，分析评价miR-363-
PDPN通路对肿瘤转移的调控作用；
2014.9 ～
撰写论文
BACK
五、参考文献
❖ [1]Petersen CP, Bordeleau ME, Pelletier J et al. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell 2006, 21, 533-542.
BACK
.
12
三、技术路线及实验难点
（一）技术路线
miR-363慢病毒载体感染头颈鳞癌细胞 后裸鼠体内注射
裸鼠尾静脉注射观察 肺转移
裸鼠爪垫祝贺观察 腘窝淋巴结转移
证实miR-363-PDPN通路在 头颈鳞癌转换中的作用
.
13
（二）技术难点
1
尾静脉注射形成淋巴 结转移需要荷瘤时间 较长，大负荷长时间 荷瘤往往导致动物的 死亡，使得淋巴结转 移模型成功率较低。
2
爪垫注射，局部组织 载荷瘤量过大，肿瘤 局部浸润生长，可能 导致局部组织的破坏 及破溃，导致裸鼠的 死亡，影响实验进程。
BACK
.
14
四. 实验进度
2014.2～2014.5 ——设计miR-363的包埋病毒，建立 肺及淋巴结转移模型；
2014.6～2014.7——荧光分子探针示踪，观察并记录 原发瘤和肿瘤转移情况；
（二）研究意义
肿瘤的侵袭与转移是导致患者死亡的主要 原因，针对头颈鳞癌侵袭转移机制的阐明，将 有利于帮助我们阐明肿瘤侵袭、转移的机制， 对发展肿瘤的新治疗策略提供理论和实验支持 ；从而发展肿瘤转移诊断治疗的新技术，将对 改善晚期转移患者无有效治疗方法的困难局面 提供帮助。
BACK
.
6
二、实验内容、方法及研究机制
❖ 2. Podoplanin(PDPN)是一种唾液粘蛋白样糖蛋
白，对其发挥凝集血小板的功能起关键性作用，研 究推测其功能可能有利于肿瘤细胞的血循转移（5）。 深入研究发现它在恶性肿瘤组织中有特征性的表达， 并有着重要的临床意义（6）。El-Naggar等（7）研究 发现90%口腔鳞癌中都有PDPN不同程度的异常表 达。研究发现，PDPN在头颈鳞癌发生中也起着重 要的作用， Mao等[3]在对口腔癌前病变-白斑的研究 结果中发现，白斑中PDPN表达程度与其组织异常 严重程度呈正相关。
.
7
（一）、实验内容
1、建立肺及 淋巴结转移模
型
实验内容
2、荧光分子探针示踪 ，观察肿瘤转移情况
3、分析评价
miR-363PDPN通路对 肿瘤转移的
调控作用
（二）、实验方法
1、建立肺及淋巴结转移模型
❖ 构建miR-363慢病毒载体，感染Rca-T细胞株， 将0.2ml含有106感染此病毒的细胞悬液分别注射到 25只4周龄的雌性裸鼠尾静脉及左后肢足蹼黏膜下 后；并将0.2ml含有106感染非miR-363载体病毒的 细胞悬液以同样的方式注射另外25只4周龄裸鼠， 来作为对照。
❖ [2] Krichevsky AM, Gabriely G. miR-21: a small multi-faceted RNA[J]. J Cell Mol Med， 2009,13(1): 39-53.
❖ [3]Yuan P, Temam S, El-Naggar A, et al. Overexpression of PDPN in oral cancer and its association with poor clinical outcome[J]. Cancer,2006,107:563-569.
（三）、研究机制
研究证实，PDPN 3’-UTR区存在有一个保守位 点及两个非保守位点，而miR-363能够直接结合并 作用于此靶向调控位点，反向调节PDPN的表达， 并且呈剂量相关性，从而抑制了肿瘤细胞的转移及 侵袭能力。本实验利用荧光分子探针示踪方法，观 察比较裸鼠肺内及腘窝淋巴结肿瘤转移情况，用免 疫组织化学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN 的表达变化，用体内实验的方法来证明miR-363PDPN通路对肿瘤转移的调控作用。
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❖ 3. 目前有研究已经通过双荧光素酶报告分析系
统、 Transwell及wound-healing等实验，证实了体 外头颈鳞癌细胞系中，miR-363可以通过调控 PDPN的表达从而对肿瘤细胞侵袭、转移能力产生 影响。并对临床病例中转移 （0.99 ± 0.14）与未 转移（1.93±0.21）头颈鳞癌组织中miR-363的表 达水平有显著性差异(P = 0.001) (9)
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2、荧光分子探针示踪，观察肿瘤转移情况
❖ 分别在14d、21d、28d、35d和42d使用IVIS-100 CCD camera(Xenogen)观察肺部肿瘤转移灶的数量和大小， 并通过Xenogen自带软件分别测量处理组以及对照组 裸鼠肿瘤灶及转移淋巴结的体积。
3、分析评价miR-363-PDPN通路对肿瘤转移的调控作用
动物体内观察miR-363对口腔鳞癌侵袭与转移的影 响及可能的调控机制
导师： 学生：
1 实验背景及意义 2 实验内容、方法及研究机制 3 技术路线以及实验难点 4 实验进度安排
5 参考文献
一、研究背景及意义
（一）研究背景
❖ 1. microRNA是一大类非编码小RNA，本身并不
编码蛋白质, 但是可以通过靶向、特异性作用mRNA 或基因启动子，导致靶mRNA降解或者抑制其翻译， 降低相关靶基因蛋白质的表达，从而发挥重要的调 控作用 [1]。目前研究已经证实，microRNA的异常 表达与疾病尤其是癌症有着密切的关系[2]。近年来 其作用及调控机制已成为国内外研究的热点，发现 microRNA在不同类型肿瘤及肿瘤的不同发展阶段 有着不同的表达[3]，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、 侵袭、转移及血管形成等过程[4]。
2014.8——免疫组织化学技术检测各种分子， 包 括miR-363及PDPN的表达变化，分析评价miR-363-
PDPN通路对肿瘤转移的调控作用；
2014.9 ～
撰写论文
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五、参考文献
❖ [1]Petersen CP, Bordeleau ME, Pelletier J et al. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell 2006, 21, 533-542.
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三、技术路线及实验难点
（一）技术路线
miR-363慢病毒载体感染头颈鳞癌细胞 后裸鼠体内注射
裸鼠尾静脉注射观察 肺转移
裸鼠爪垫祝贺观察 腘窝淋巴结转移
证实miR-363-PDPN通路在 头颈鳞癌转换中的作用
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（二）技术难点
1
尾静脉注射形成淋巴 结转移需要荷瘤时间 较长，大负荷长时间 荷瘤往往导致动物的 死亡，使得淋巴结转 移模型成功率较低。
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爪垫注射，局部组织 载荷瘤量过大，肿瘤 局部浸润生长，可能 导致局部组织的破坏 及破溃，导致裸鼠的 死亡，影响实验进程。
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四. 实验进度
2014.2～2014.5 ——设计miR-363的包埋病毒，建立 肺及淋巴结转移模型；
2014.6～2014.7——荧光分子探针示踪，观察并记录 原发瘤和肿瘤转移情况；
（二）研究意义
肿瘤的侵袭与转移是导致患者死亡的主要 原因，针对头颈鳞癌侵袭转移机制的阐明，将 有利于帮助我们阐明肿瘤侵袭、转移的机制， 对发展肿瘤的新治疗策略提供理论和实验支持 ；从而发展肿瘤转移诊断治疗的新技术，将对 改善晚期转移患者无有效治疗方法的困难局面 提供帮助。
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二、实验内容、方法及研究机制
❖ 2. Podoplanin(PDPN)是一种唾液粘蛋白样糖蛋
白，对其发挥凝集血小板的功能起关键性作用，研 究推测其功能可能有利于肿瘤细胞的血循转移（5）。 深入研究发现它在恶性肿瘤组织中有特征性的表达， 并有着重要的临床意义（6）。El-Naggar等（7）研究 发现90%口腔鳞癌中都有PDPN不同程度的异常表 达。研究发现，PDPN在头颈鳞癌发生中也起着重 要的作用， Mao等[3]在对口腔癌前病变-白斑的研究 结果中发现，白斑中PDPN表达程度与其组织异常 严重程度呈正相关。
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（一）、实验内容
1、建立肺及 淋巴结转移模
型
实验内容
2、荧光分子探针示踪 ，观察肿瘤转移情况
3、分析评价
miR-363PDPN通路对 肿瘤转移的
调控作用
（二）、实验方法
1、建立肺及淋巴结转移模型
❖ 构建miR-363慢病毒载体，感染Rca-T细胞株， 将0.2ml含有106感染此病毒的细胞悬液分别注射到 25只4周龄的雌性裸鼠尾静脉及左后肢足蹼黏膜下 后；并将0.2ml含有106感染非miR-363载体病毒的 细胞悬液以同样的方式注射另外25只4周龄裸鼠， 来作为对照。
❖ [2] Krichevsky AM, Gabriely G. miR-21: a small multi-faceted RNA[J]. J Cell Mol Med， 2009,13(1): 39-53.
❖ [3]Yuan P, Temam S, El-Naggar A, et al. Overexpression of PDPN in oral cancer and its association with poor clinical outcome[J]. Cancer,2006,107:563-569.