分子克隆及蛋白表达
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分子克隆及蛋白表达 常见问题和对策
南京师范大学生命科学学院
一、重要意义与应用
（一）重要意义 分子克隆技术起步于上世纪70年代
1、开辟了分子生物学研究的新领域； 2、打开了人类了解、识别、分离和改造基
因，创造新物种的大门； 3、对工业、农牧和医药业产生深远影响； 4、将为解决世界面临的能源、食品和环保
1973年初，他们推出了一系列实验，以选择特定 的外源基因在细菌中复制。
二、基因克隆
（二） 什么是基因
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定 核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片 段。
基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种 的不同个体表现出不同的性状的根本原因。
"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。 基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给
（二）载体的选择
基因工Biblioteka Baidu的载体的性质：
1、在宿主细胞中有独立复制和表达的能力，能使外 源重组的DNA片段得以扩增； 2、分子量尽可能小，在宿主细胞中有较多的拷贝， 便于结合更大的外源DNA片段，并在实验操作中不 易被机械剪切破坏； 3）最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗 药性标记基因），以赋予宿主细胞不同的表型（如 对抗生素的抗性）。
分子。
三、克隆过程概述
基因组DNA较大，不利于克隆，需将其 处理成适合克隆的DNA小片段。 常用的方法：机械切割和核酸限制性内切酶消化
若基因序列已知且较小可直接合成。若基 因的两端部分序列已知，根据已知序列设计 引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技 术可以获得目的基因。
三、克隆过程概述
食品工业：
利用细菌可生产蛋白质、氨基酸和糖等。
一、重要意义与应用
（三） 在制药工业中应用 利用分子克隆和发酵技术已工业化生产
重组蛋白药物及相关产品：胰岛素、人牛 鸡的生长激素、人干扰素、松弛素、促红 细胞生长激素、乙肝病毒抗原和口蹄疫病 毒抗原等。
利用分子克隆技术还可提高微生物本身 所产生的蛋白和抗生素类药物的产量。
三大危机开拓新的出路。
一、重要意义与应用
（二）在工业生产中的应用
分子克隆技术
基因 工程
细胞 工程
酶工 程
发酵 工程
紧密联系、综合利用
一、重要意义与应用
利用分子克隆技术生产的化学试剂：
丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙 烷、乌头酸和水杨酸等。
污水处理：
利用基因操作，将某种微生物的基因转入另一微 生物，创造对有害物质降解能力更强的新菌种，以 分解污水中的有毒物质。
下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到 表达。
二、基因克隆
（三）基因克隆的概念 基因克隆是70年代发展起来的一项具有
革命性的生物技术，最终目的在于通过相应 技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿 主细胞内目的基因被大量的复制。
该技术可概括为∶分、切、连、转、选。
二、基因克隆
切：用序列特异的限制性内切酶切开载体 DNA，即切出目的基因；
二、基因克隆
（四）基因克隆的基本过程 基因克隆涉及一系列的分子生物学技术
，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各 种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞 技术和重组子筛选技术等等。
三、克隆过程概述
（一）目的DNA片段的获得
基因克隆的第一步是获得包含目的基因在 内的一群DNA分子 。 DNA分子的来源： 1、目的生物基因组； 2、目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA
一、重要意义与应用
（四） 在基因治疗中的应用 通过基因水平的操纵而治疗或预防疾病。
基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活
1990 年，NIH进行了世界上首例基因治疗临床试验
修复了一个复合免疫缺陷综合征女孩腺苷脱氨酶的活性， 使其免疫系统得到了恢复。
2012 年，首个基因治疗产品获批上市
欧洲药品管理局批准荷兰生物技术公司UniQure 以重组 腺相关病毒( AAV) 为载体的基因治疗药物Glybera上市，用于 脂蛋白脂酶缺乏症( LPLD) 患者的治疗。
一、重要意义与应用
（五） 在农业生产中的应用 许多外源基因导入植物的研究获得成功。
培育新品种 、作物品质改良、促进作物增 产、防除杂草、防治病虫害、抗病菌 等。
影响植物基因工程在农业中应用的因素： 1、对人体的安全性问题 2、转基因DNA 在作物生长中转移或漂移至其他作物，从而 引发环境及生态问题 3、转基因作物在农产品贸易中的问题
二、基因克隆
（三）最初的基因克隆实验
1972年，斯坦福大学的 P.Berg 等人将一种猿 猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切 酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子相连 接，产生了一种新的重组DNA分子，奠定了基因克 隆技术的基础。
1973年， S.Cohen 等人把一段外源DNA片段与 质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该 重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立了基因 克隆体系。
一、重要意义与应用
基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定 点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学 研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科 研将寸步难行。
二、基因克隆
（一）分子克隆技术的诞生
1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次 出现基因克隆技术的想法。
Stanley Cohen （1986年诺奖获得者），对 Herbert W.Boyer 关于细菌酶切割DNA分子特定部 分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两 位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产 业的实验。
一、重要意义与应用
（六） 在基因功能研究中的应用
1982年，《 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 》由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，这部著作在20年中成为指导生命科学研 究的一部“圣经”。
分子生物学技术目前已经是几乎所有主流实验室 的必备技术，其中基因克隆技术作为基础和首要技 术，是大部分科研同行接触到的第一种分子生物学 技术。
连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相 连接，形成重组DNA分子；
转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复 制和扩增；
选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分 子的个体。
二、基因克隆
基因工程技术的两个最基本的特点： 1、分子水平上的操作 2、细胞水平上的表达
分子水平上的操作即是体外重组的过程， 是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。 基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性 繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工 程等。
南京师范大学生命科学学院
一、重要意义与应用
（一）重要意义 分子克隆技术起步于上世纪70年代
1、开辟了分子生物学研究的新领域； 2、打开了人类了解、识别、分离和改造基
因，创造新物种的大门； 3、对工业、农牧和医药业产生深远影响； 4、将为解决世界面临的能源、食品和环保
1973年初，他们推出了一系列实验，以选择特定 的外源基因在细菌中复制。
二、基因克隆
（二） 什么是基因
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定 核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片 段。
基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种 的不同个体表现出不同的性状的根本原因。
"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。 基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给
（二）载体的选择
基因工Biblioteka Baidu的载体的性质：
1、在宿主细胞中有独立复制和表达的能力，能使外 源重组的DNA片段得以扩增； 2、分子量尽可能小，在宿主细胞中有较多的拷贝， 便于结合更大的外源DNA片段，并在实验操作中不 易被机械剪切破坏； 3）最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗 药性标记基因），以赋予宿主细胞不同的表型（如 对抗生素的抗性）。
分子。
三、克隆过程概述
基因组DNA较大，不利于克隆，需将其 处理成适合克隆的DNA小片段。 常用的方法：机械切割和核酸限制性内切酶消化
若基因序列已知且较小可直接合成。若基 因的两端部分序列已知，根据已知序列设计 引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技 术可以获得目的基因。
三、克隆过程概述
食品工业：
利用细菌可生产蛋白质、氨基酸和糖等。
一、重要意义与应用
（三） 在制药工业中应用 利用分子克隆和发酵技术已工业化生产
重组蛋白药物及相关产品：胰岛素、人牛 鸡的生长激素、人干扰素、松弛素、促红 细胞生长激素、乙肝病毒抗原和口蹄疫病 毒抗原等。
利用分子克隆技术还可提高微生物本身 所产生的蛋白和抗生素类药物的产量。
三大危机开拓新的出路。
一、重要意义与应用
（二）在工业生产中的应用
分子克隆技术
基因 工程
细胞 工程
酶工 程
发酵 工程
紧密联系、综合利用
一、重要意义与应用
利用分子克隆技术生产的化学试剂：
丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙 烷、乌头酸和水杨酸等。
污水处理：
利用基因操作，将某种微生物的基因转入另一微 生物，创造对有害物质降解能力更强的新菌种，以 分解污水中的有毒物质。
下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到 表达。
二、基因克隆
（三）基因克隆的概念 基因克隆是70年代发展起来的一项具有
革命性的生物技术，最终目的在于通过相应 技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿 主细胞内目的基因被大量的复制。
该技术可概括为∶分、切、连、转、选。
二、基因克隆
切：用序列特异的限制性内切酶切开载体 DNA，即切出目的基因；
二、基因克隆
（四）基因克隆的基本过程 基因克隆涉及一系列的分子生物学技术
，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各 种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞 技术和重组子筛选技术等等。
三、克隆过程概述
（一）目的DNA片段的获得
基因克隆的第一步是获得包含目的基因在 内的一群DNA分子 。 DNA分子的来源： 1、目的生物基因组； 2、目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA
一、重要意义与应用
（四） 在基因治疗中的应用 通过基因水平的操纵而治疗或预防疾病。
基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活
1990 年，NIH进行了世界上首例基因治疗临床试验
修复了一个复合免疫缺陷综合征女孩腺苷脱氨酶的活性， 使其免疫系统得到了恢复。
2012 年，首个基因治疗产品获批上市
欧洲药品管理局批准荷兰生物技术公司UniQure 以重组 腺相关病毒( AAV) 为载体的基因治疗药物Glybera上市，用于 脂蛋白脂酶缺乏症( LPLD) 患者的治疗。
一、重要意义与应用
（五） 在农业生产中的应用 许多外源基因导入植物的研究获得成功。
培育新品种 、作物品质改良、促进作物增 产、防除杂草、防治病虫害、抗病菌 等。
影响植物基因工程在农业中应用的因素： 1、对人体的安全性问题 2、转基因DNA 在作物生长中转移或漂移至其他作物，从而 引发环境及生态问题 3、转基因作物在农产品贸易中的问题
二、基因克隆
（三）最初的基因克隆实验
1972年，斯坦福大学的 P.Berg 等人将一种猿 猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切 酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子相连 接，产生了一种新的重组DNA分子，奠定了基因克 隆技术的基础。
1973年， S.Cohen 等人把一段外源DNA片段与 质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该 重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立了基因 克隆体系。
一、重要意义与应用
基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定 点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学 研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科 研将寸步难行。
二、基因克隆
（一）分子克隆技术的诞生
1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次 出现基因克隆技术的想法。
Stanley Cohen （1986年诺奖获得者），对 Herbert W.Boyer 关于细菌酶切割DNA分子特定部 分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两 位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产 业的实验。
一、重要意义与应用
（六） 在基因功能研究中的应用
1982年，《 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 》由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，这部著作在20年中成为指导生命科学研 究的一部“圣经”。
分子生物学技术目前已经是几乎所有主流实验室 的必备技术，其中基因克隆技术作为基础和首要技 术，是大部分科研同行接触到的第一种分子生物学 技术。
连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相 连接，形成重组DNA分子；
转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复 制和扩增；
选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分 子的个体。
二、基因克隆
基因工程技术的两个最基本的特点： 1、分子水平上的操作 2、细胞水平上的表达
分子水平上的操作即是体外重组的过程， 是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。 基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性 繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工 程等。