SNP检测方法(讲课版)1

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2）杂交+荧光共振
分子信标（双分子间杂交） 蝎状探针（分子内杂交）
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分子信标（Molecular beacons）
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蝎状探针 （Scorpion primer）
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2.基于酶的方法
1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H
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1）DNA聚合酶
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2.现状： 到现在还没有一个符合以上条件的理想方 法出现,但根据实际情况,可以选择出较合 适方法。
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3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。
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SNPs检测方法的分类
一、区分SNPs 位点的 方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法 二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术
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APEX (arrayed primer extension)——固相
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焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )


DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、 荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶 ( apyrase) 。 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进 行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随 焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下 能引一种发化学发光反应,通过发光计的实 时监测来达到检测的目的。

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核酸肽探针 （Peptide nucleic acids，PNA)
其骨架是肽键 特点： 1、与靶分子高特异性地结 合（3个方面的影响） 2、链挤入 （形成三链复合 结构）（表达调控以及 反义治疗方面） 3、对核酸酶和蛋白酶均不 敏感（体外应用）

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1、与靶分子高特异性地结合
Tm值高 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其 Tm值降低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好 的排除。
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基本步骤
1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与 酶和底物孵育。 2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加 入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价 键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。 3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰 高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬 灭光信号，并再生反应体系。 5.然后加入下一种dNTP。
SNPs的检测方法
2007.4.12
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SNPs的定义
定义：单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因 组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。 (99.9%)
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SNPs的研究意义
1. SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可 遗传性、可检测性），用于疾病基因的 定位、克隆和鉴定。___路标的作用 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学（表型、基因、蛋白），
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2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、 病理条件下的千差万别）
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SNPs研究进展和方向
1. SNPs数据库的构建发现 2. SNPs功能的研究（在1的基础上）
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SNPs检测方法
1.理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧） (2) 快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高） (3) 费用相对低廉
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1.基于杂交的方法

原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进 行杂交时，完全匹配和有错配两种情况 下，根据杂交复合体稳定性的不同而将 SNPs 位点检测出来。 （差异越大，检 测的特异性就越好）
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1）利用△Tm
固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等 动态的加热过程 ——动态等位基因特异 杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH)

等位基因特异性PCR 多重等位基因特异性PCR Taqman法 引物延伸法 焦磷酸测序法
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等位基因特异性PCR
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Taqman 法
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微测序法/引物延伸法
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基本步骤（液相）
1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP) 3.引物延伸 4.延伸产物检测（ 放射性同位素标记法、 发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等）

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LNA(locked nucleic acids)
其结构是在RNA分子的2′ 羟基和核糖环的4′碳原 子间连入一个亚甲基的 “桥”。 特点： 1.能以很高的亲和性和互 补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交 的稳定） 2.匹配和不匹配的△Tm增 加

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DASH
(dynamic allele-specific hybridization）
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2)连接酶


联合链式反应 (combined chain reaction , CCR) 连接-滚环扩增反应 (ligation-rolling circle amplication , LRCA)
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