时间分辨荧光免疫技术

1979年，芬兰SOINI和HEMMIA 提出“时间分辨荧光免疫分析”理论 1983年SOINI和KOJOLA 提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨 荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量 分析技术 现已经成为生物医学研究和临床超微量生 化检验中一项最有发展前景的分析手段。
厂

家
芬兰的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大 使用激光，主要在科研 WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床

镧系元素荧光特点：

荧光寿命极长

镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> 普通荧光免疫中荧光团：1~100ns 样本中蛋白质荧光：1~10ns，易猝灭。 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移近280nm

Stokes位移大


荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615± 5nm）

（3）HBcAb浓度的高低可以反映病毒感染的状态
1、乙肝急性感染常为高滴度的HBcAb，恢复期浓度下降，慢性乙肝 HBcAb呈持续高浓度。 2、低浓度的HBcAb一般为恢复期或既往感染。

（4）有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断
非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定 活动性慢性乙肝往往呈进行性变化

三、乙肝疫苗接种
HBsAb是一种真正意义的保护性抗体，其定量的检测可以对其具有的免疫力做出正 确的评价，对乙肝的预防起到监督作用。
定 量
0~10mIU/ml
10~100mIU/ml
ELISA（定性）
阴性（-）
阳性（+）`
意 义
机体对乙肝病毒无免疫力，易感染 乙肝病毒
机体对乙肝病毒的免疫力很弱，甚 至不能预防HBV感染，仍有感染 HBV的危险 机体对乙肝病毒有较强的免疫力， 使机体有抵抗HBV入侵的作用，较 大程度上减少感染HBV的风险

单个样本检测速度快，适合做 急诊。 灵敏度较高。 自动化程度高。 仪器种类：

拜耳 — ACS180 系列 雅培 — AXSYM 贝克曼 — ACCESS 德普 — IMMULITE
电化学发光免疫分析（ECL） ---标记物：三联吡啶钌
应用

缺点



80年代末期问世的新型化学发 光免疫分析方法。 基本原理：根据三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发 下产生发光的化学发光反应。 本底较小、灵敏度较高、线性 范围较宽。
（时间分辨荧光法）
乙肝核心抗体免疫反应图
（时间分辨荧光法）
时间分辨荧光免疫的试剂种类







甲状腺功能检测 TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG 性激素类检测 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG 肿瘤标记检测 AFP，CEA，PSA，hTG，β-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total）， PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199 遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPA 新生儿筛查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17aOH Prog，PKU 传染病检测 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 血液科检测 贫血检查： Ferritin，Vit B12，Folic acid 科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测
定

义
TrFIA分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作 为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记 蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物 活性细胞，当反应体系发生后，用TRF仪器测 定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对 荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓 度，达到定量分析之目的。
发展历程
时间分辨荧光免疫的原理



用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位 素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质； 当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特 点 （Ⅰ特异性强、 ⅡStokes位移大、 Ⅲ寿命长），并采用解 离-增强技术（ Ⅳ DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨 荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值， 以达到定量分析的目的。



仪器检测速度慢 （罗氏公司） ECL1010 —— 60 测试/小时 ECL2010 —— 90 测试/小时 非开放性试剂系统、不能做科 研。 试剂价格过高。
TRFIA在乙肝“两对半” 定量检测应用

一、提高了检测的灵敏度
时间分辨荧光法（TRFIA）检测HBsAg灵敏度可达到0.2ng/ml，而酶 免法（ELISA）检测HBsAg灵敏度是2ng/ml。 缩短了急性乙肝检测的“窗口期”

（2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可以反 映病情变化和治疗效果。
1、HBeAg向HBeAb转换时期，即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb浓度 升高。 2、高浓度的HBeAg提示病毒处于高复制状态，有较强传染性。 3、高浓度的HBeAb一方面提示病情的好转，但在有些时候（如肝功能指 标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。
利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激 发荧光分辨开来，零本底的又一保障
发射光谱与激发
光谱间存在的巨
大Stokes位移。
可以通过干涉滤 光片将发射光谱 与激发光谱完全
图2
分离。
稀土离子激发光、发射光和Stokes位移
稀土离子螯 合物 Eu-螯合物 Sm-螯合物 Tb-螯合物 Dy-螯合物 激发光波长 （nm） 340 340 295 295 发射光波长 （nm） 613 600 490/543 573 Stokes位移 （nm） 273 260 195/248 278

待测物质浓度与检测手段
临床化学分析
10-12 10-9 10-6 10-3 10-0
pg/mL
ng/mL
mg/mL
mg/mL
g/L
免疫分析
Therapeutic Drugs (药物浓度) Thyroid Hormone (甲状腺激素) Fertility Hormone (孕激素) Cancer Markers (肿瘤标记物) Infectious Disease (传染病) Vitamins (维生素) Serum Proteins (血清蛋白)
时间分辨荧光免疫原理图 （Time-resolved Fluorescence Immunoassay）
乙肝“两对半” TRFIA定 量检测原理示意图
乙肝表面抗原免疫反应图
（时间分辨荧光法）
乙肝表面抗体免疫反应图
（时间分辨荧光法）
乙肝ｅ抗原免疫反应图
（时间分辨荧光法）
乙肝ｅ抗体免疫反应图

标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素
镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中 有四种：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ


铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)
Eu3 +的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术
不同的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自不同的荧光寿命等特点，这 样就适合进行双标记和多标记，从而实现可同时检测一个样品中，两种 或两种以上的抗原或抗体，即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂 盒，这就是我们所说的多标记技术。
二、动态观察疗效和病情检测
疾病的发生、发展、疗效、预后是个动态的变化过程， TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙 肝的病程、治疗、预后起到动态检测的作用，指导医生治疗。
（1）定量分析HBsAg和HBsAb浓度的变化，可以预
见急性乙肝是否处于恢复期
如HBsAg浓度降低，HBsAb逐渐升高，说明病情正向恢复期发展反 之。反之，HBsAg浓度处于高水平或上升，而HBsAb处于低水平，则容 易发展为慢性乙肝或携带者。

灵敏度、重复性不及放免，易造成 漏检和假阳性。 因酶的纯度和反应过程容易受环境 因素影响，导致稳定性不好。
荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术 磁酶免分析


曾经一度被认为是取代放免 的检测手段。
化学发光免疫分析法（CLIA） ---标记物： 化学发光物质（鲁米诺）
应用

缺点
• 样品不能重复检测；出现故障则整 批试剂及血样报废。 • 本底较高，易受环境物质干扰。 • 仪器故障率较高。 • 标准曲线稳定性较差，需多次定标。 • 检测精度不高，在超微量分析及早 期诊断方面能力不足。 • 非开放性试剂；试剂价格高。
解离增强技术
★ 解离增强技术是TRF技术中所特有的 ★ 指当免疫反应完成后部分标记物结合到固相载
体上，未结合的标记物被洗掉。 ★ 再加入低PH值（PH2~3）的增强液，把Eu或 Sm从免疫复合物中解离下来，与增强液中的 螯合物质（β -二酮体）结合形成新的螯合物， 使标记物产生的荧光强度增强近百万倍
时间分辨荧光免疫技术
问
题
★什么是时间分辨荧光免疫分析（TrFIA ）？ ★TrFIA的标记物及特点。 ★为什么叫“时间分辨”? ★TrFIA的检测原理 ★各种免疫方法学的比较 ★ TrFIA的 临床应用
时间分辨荧光免疫 （TrFIA）
（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）
放免自60年代问世以 来对临床诊断起了革 命性的贡献，是一项 较为成熟的诊断技术。


夹心法、竞争法的标 记原理为以后的检测 技术的发展奠定了基 础。


酶免疫分析法（ELISA ）
---标记物：HRP(辣根过氧化物酶）
应用

缺点


酶免的最大优势在于避免了 对环境和人体危害。 试剂有效期较长。 衍生技术：
各种免疫方法学的比较
放射性免疫分析法（RIA） ---标记物： 125I
应用

缺点
放射性（125I），对环境的污染及对 身体的危害，已经为重视环保的国家 逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个 放免试验室） 125I 的半衰期短而导致其试剂有效期 短。 标记物 125I 的稳定性差，导致试剂盒 批间、批内的变异较大；标准曲线有 效期短，必须每次定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。 无法保存备用。
时间分辨荧光免疫分析与其它 免疫学方法的比较
标记免疫学发展历程
酶联免疫 （精度：10-9 mol/L ） 酶免疫技术 放射免疫 （精度：10-12mol/L ） 化学发光 （精度：10-15mol/L ）


三大标记技术 电化学发光 （精度：10-17mol/L ）
荧光抗体技术
时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 放射免疫分析 生物芯片 （未知）
解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
时间分辨
生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于400-600nm，所 以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。
样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10ns
TrFIA技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高， 而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6 个数量级（1000ns=1us)。 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。 因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变 后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样 品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除 样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的 时间分辨。
通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使本底达到0
利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光。而在此时
间之前，非特异性荧
光已完全衰减为0
图1
Stokes位移


Stokes位移：是指激发光谱与发射光谱之间的 光谱波峰的波长差。 例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波 长613nm，两者之间的波长差即Stokes位移为 273nm（见图2），所以激发光和发射光很容 易用干涉滤光片分开。 而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长 差即Stokes位移为28nm，那就很难排除激发 光对发射光的干扰，影响检测结果。
>100mIU/ml
阳性（+）
由此可见定量测定对乙肝疫苗免疫力的评 估和高危人群预防免疫具有重要意义，特别 是在少年儿童预防乙肝方面