多糖的分离纯化及分析

多糖的分离纯化及分析
一、多糖的提取方法
（一）溶剂提取法
1、水提法
水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.
2、酸碱提法
有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。

有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。

与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。

3、超临界流体萃取法
超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.
（二）生物酶提取法
酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。

此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。

（三）超声提取法
超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。

超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。

（四）微波提取
微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。

二、多糖的分离纯化
（一）多糖的分离
采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的．可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级．
1、按溶解性不同分离
（1）分步沉淀法
分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀．
（2）盐析法
盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。

常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中以硫酸铵最佳。

2 、按电离性质不同分离
季胺盐沉淀法
季胺氢氧化物是一类乳化剂，能与酸性多糖形成不溶性化合物季铵络合物，此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而产生沉淀。

若提高多糖液pH值或加入硼砂缓冲液，也可使中性多糖沉淀分离。

常用季铵盐有十六烷基三甲基季铵盐的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。

3 、柱层析法
（1）凝胶柱层析法
凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。

（2）纤维素阴离子交换剂柱层析法
纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为DEAE一纤维素和ECTEOLA 一纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。

如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。

（3）活性炭柱层析法
活性炭吸附量大、效率高，是分离水溶性物质的常用吸附剂。

柱层析时活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀释剂，以增加溶液的流速。

糖溶液上柱后先用水洗脱无机盐、单糖等再依次增加乙醇浓度进行洗脱。

（4）离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法
有些植物的多糖成分复杂，除中性多糖外，还含有糖醛酸等，因此往往两种不同性质的色谱柱联用才能得到单一多糖组分。

（5）三种层析柱联用
采用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用，即先进行DEAE—SephadexA柱层析，用蒸馏水洗脱。

水洗组分进一步用SephacrylS柱层析，得到主要组分再用SephadexG一100柱层析，有时会有较高的得率。

4、色谱分离法
常用两种色谱分离方法：一是凝胶柱色谱法，二是离子交换色谱法.
5、膜分离法
膜分离技术（MST）是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分有选择性的通过膜.目前应用较多的是超滤和微滤技术.
（二）多糖的纯化
1、除蛋白：除蛋白质时一般选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。

但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。

Sevage 法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有较好效果但要达到除尽游离蛋白质的目的仍需反复处理。

冻融和等电点沉淀除蛋白质操作简单，但多糖液里往往有低浓度的蛋白质残留，应与其它方法结合使用。

2、脱色：植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜色较深，可用吸附剂(纤维素、硅藻土、活性炭等)、离子交换柱(DEAE一纤维素)、氧化剂(H2O2)等脱除。

活性炭比表面积大，吸附能力强，在进行当归多糖的提取时只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸后滤过即完成了脱色操作。

3、除小分子杂质：小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。

传统的方法是透析法，该法操作简单、技术成熟，但周期长，往往需要2一3天。

而纤维滤器透析法利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级，这种方式可缩短生产周期，而且条件温和。

三、多糖的分析鉴定
1、含量的测定
测定方法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法、HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法等.每种方法只对某些多糖的测量效果好.比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析. 2、纯度鉴定
多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分.多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC法等.现在应用较多的是HLPC法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法.
3、分子量的测定
多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作.常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法、MALDI－TOF －MS法.
4、结构测定
（1）多糖一级结构测定
多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目、连接方式及苷建构型.常用化学法和仪器分析法.多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析.仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法.
（2）多糖高级结构测定
目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术，如2D－NMR，13C谱，通用的方法是将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算.圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析。