第八章 非水相酶催化

⏹第八章非水相酶催化
⏹概述酶催化反应的介质
⏹第一节有机介质中的酶促反应概述
⏹第二节有机介质中酶促反应的条件
⏹第三节有机介质对酶性质的影响
⏹第四节有机介质中酶促反应应用举例
⏹酶催化反应的介质
⏹酶非水相催化的几种类型
⏹酶非水相催化的几种类型
⏹第一节有机介质中的酶促反应概述
⏹一．有机相酶反应的优点：
⏹二．有机相酶反应具备条件
⏹三．有机相酶反应的研究进展
⏹四．有机相酶反应的应用现状
⏹一．有机相酶反应的优点：
⏹1．有利于疏水性底物的反应。

⏹2．可提高酶的热稳定性，扩大反应pH值的适应性。

⏹3．可改变反应平衡移动方向,能催化在水中不能进行的反应。

Eg:脂肪酶在水中催化油脂水解，有机溶剂中催化酯化、转酯化、氨解多种反应。

P179(2)
⏹一．有机相酶反应的优点：
⏹4．可控制底物专一性，可防止由水引起的副反应。

Eg：酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移。

P179(3)
⏹5．酶易于实现固定化。

⏹6．酶和产物易于回收。

（低沸点溶剂更易分离纯化产物)
⏹7．可避免微生物污染。

⏹有机介质反应体系
⏹一、非极性有机溶剂−酶悬浮体系(微水介质体系)
用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。

但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。

酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。

⏹二、与水互溶的有机溶剂−水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。

酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。

⏹三、非极性有机溶剂−水两相/多相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。

⏹反应体系中水对酶催化反应的影响
⏹酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。

所以酶
在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。

有机介质中的水含量多
少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关
系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。

⏹酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。

在无水的条件下，酶的空
间构象被破坏，酶将变性失活。

故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空
间构象。

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。

⏹有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。

存在最适水含量。

⏹二．有机相酶反应具备条件
⏹1．保证必需水含量。

⏹2．选择合适的酶及酶形式。

⏹3．选择合适的溶剂及反应体系。

⏹4．选择最佳pH值。

⏹三．有机相酶反应的研究进展
⏹1．超临界流体中的酶反应
⏹2．仿水溶剂和印迹技术
⏹1．超临界流体中的酶反应
⏹超临界流体的概念:
⏹指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶
解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。

⏹超临界流体的有关性质
⏹（1）超临界流体的P-V-T性质
⏹超临界流体的有关性质
⏹（2）所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，
临界压力7.28Mpa)时的状态。

该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。

⏹超临界流体的有关性质
⏹（3）提高溶剂选择性的基本原则是：
⏹第一：操作温度和超临界流体的临界温度接近；
⏹第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化
⏹学性质接近。

⏹超临界流体萃取的应用实例
⏹2．仿水溶剂和印迹技术
⏹（1）仿水溶剂体系
⏹（2）分子印迹技术
⏹（1）仿水溶剂体系
⏹原理:
⏹可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的
辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。

⏹应用举例：
⏹通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应
产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。

⏹（2）分子印迹技术
⏹ e.g. 1
⏹当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，
再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干
出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。

⏹分子印迹技术原理：
⏹竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种
构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。

⏹酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。

⏹第一节结束
优点
具备条件
研究进展
应用现状
⏹第一节结束
⏹点击返回
⏹第二节有机介质中酶促反应的条件
⏹一．必需水
⏹二．酶的选择
⏹三．溶剂及反应体系的选择
⏹四．pH选择和离子强度的影响
⏹一．必需水
⏹概念：
⏹紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。

⏹一．必需水
⏹
⏹ 2 ．干燥的酶水合过程：
⏹（1）与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）
⏹（2）与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)
⏹（3）凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.25~0.38g/g）
⏹（4）酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。

⏹3．影响酶反应体系中需水含的因素
a．不同酶需水量不同
b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同
溶剂疏水性越强，需水量越少
⏹胰脂肪酶活性与含水量的关系
⏹4．表征必需水作用的参数---热力学水活度
⏹即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。

该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。

⏹二酶的选择
⏹ 1 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。

⏹除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。

⏹2．酶形式的选择
⏹（1）酶粉：
⏹例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶
量的减少而显著增加。

⏹二．酶的选择
⏹（２）化学修饰酶：
⏹例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均高
于天然SOD。

⏹二．酶的选择
⏹（３）固定化酶：
⏹把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有
机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。

⏹三．溶剂及反应体系的选择
⏹水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等
⏹水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等⏹1．酶促反应有机介质体系
⏹（1）单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂）
⏹（２）两相体系（水/水不溶性有机溶剂）
⏹（３）低水有机溶剂体系（有机溶剂体系）
⏹（４）反胶束体系☆
⏹ A.反胶束体系概念
⏹反胶束体系：
⏹是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。

反胶束溶液
是透明的热力学稳定的系统。

⏹概念表面活性剂
⏹表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分
组成的两性分子。

⏹在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：
⏹AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。

⏹概念临胶束浓度
⏹临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。

⏹CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。

⏹概念
⏹正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。

⏹反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极
性核。

⏹ B.反胶束体系的制备
⏹将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便
会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。

⏹反胶束体系的制备
⏹影响因素
⏹反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、
离子强度的影响。

⏹反胶束体系中的含水量
⏹反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。

Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活
性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。

⏹C．基本原理：“水壳”模型
⏹反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。

结合水是指位于反胶束内部形成水
池的那部分水；
⏹自由水即为存在于水相中的那部分水。

⏹“水壳”模型
⏹水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。

⏹ 1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层。

⏹ 2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。

⏹ 3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。

⏹D．影响的主要因素
⏹水相pH值的影响
⏹离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定
⏹表面活性剂浓度的影响
⏹离子种类对萃取的影响
⏹双水相体系将头孢立新得率提高3倍
⏹2．有机溶剂影响酶催化的方式
⏹（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活
⏹2．有机溶剂影响酶催化的方式
⏹（2）有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活
⏹3）有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用。

⏹3．选择有机溶剂必须考虑因素
⏹(1). 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产
物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。

)
⏹相容性
⏹例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不
溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）
⏹(2). 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。

⏹例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，
就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。

⏹(3)必须考虑的其他因素
⏹溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）
⏹溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映
溶剂的疏水性。

⏹生物催化剂的环境调控技术
⏹四．PH选择和离子强度的影响
⏹（1）pH选择：
⏹在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。

酶在水相的pH值可在
有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。

⏹（2）离子强度影响
⏹随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。

⏹第二节结束
必需水
酶的选择
溶剂及反应体系
pH选择和离子强度
⏹第二节结束
⏹点击返回
⏹第三节有机介质对酶性质的影响
⏹一、稳定性
⏹二、活性
⏹三、专一性
⏹四、反应平衡方向
⏹一、稳定性
⏹（１）热稳定性提高
⏹（２）储存稳定性提高
⏹一、稳定性
⏹结论
⏹在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；
⏹一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；
⏹含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。

⏹二活性
⏹刚-柔并存
⏹刚性：生物大分子结构的精确性
⏹柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。

⏹二、活性
⏹1、单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响
⏹（1）有机溶剂直接作用于酶
⏹（2）有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）
达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。

⏹2、低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化
⏹例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活
性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化
⏹3、在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加
⏹超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。

⏹认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。

⏹超活性产生机理
⏹三、专一性
⏹某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的
结果。

⏹有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。

⏹四、反应平衡方向
⏹第三节结束
稳定性
活性☆
专一性
反应平衡方向
⏹第三节结束
⏹点击返回
⏹第四节有机介质中酶催化的应用
⏹有机介质中酶催化的应用
⏹手性药物的拆分
⏹手性高分子聚合物的制备
⏹酚树脂的合成
⏹导电有机聚合物的合成
⏹发光有机聚合物的合成
⏹有机介质中酶催化的应用
⏹食品添加剂的生产
⏹多肽的合成
⏹甾体转化
⏹生物能源
⏹一．手性药物的拆分
⏹概念：
⏹手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物⏹ 1 手性药物两种对映体的药效差异
⏹一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效
⏹一种有显著疗效，另一种有毒副作用
⏹两种对映体的药效相反
⏹两种对映体具有各自不同的药效
⏹两种消旋体的作用具有互补性
⏹2．手性药物的拆分方法
⏹分为：非生物法、生物法
⏹非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分）⏹生物拆分法原理
⏹实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择
性，从而使反应产物具有光学活性。

⏹三酚树脂的合成
⏹例
⏹辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质
聚合，生成酚类聚合物
⏹四导电有机聚合物的合成
⏹例
⏹辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催
化苯胺聚合生成聚苯胺。

⏹五发光有机聚合物的合成
⏹例
⏹辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合
物制成二极管，可以发出蓝光。

⏹六食品添加剂的生产
⏹利用芳香醛脱氢酶生成香兰素
⏹七多肽的合成
⏹例
⏹a-胰蛋白酶可以催化N- 乙酰色氨酸与亮氨酸合成二肽
⏹水中反应合成率为0.1%以下
⏹在乙酸乙酯和微量水组成的系统中，合成率可达100%
⏹八甾体转化
⏹例
⏹可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，
转化率高达100%和90%
⏹九生物能源
⏹典型案例-生物柴油的生产
⏹生物柴油
⏹生物柴油的生产方法
⏹目前生物柴油主要是用化学法生产，采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转酯反应，
而生成脂肪酸甲酯。

反应时间短，成本低。

但在反应过程中使用过量的甲醇，而使后处理过程变得较为繁杂。

能耗高；色泽深，在高温下容易变质；酯化产物难于回收；生产过程有废碱液排放
⏹新方法：生物酶法，在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与小分子醇类的酯交换反
应，生成小分子的酯类混合物。

条件温和，醇用量小、无污染排放。

缺点：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%～60%，酶的使用寿命短。

副产物甘油和水难于回收，不但对产物形成抑制，而且甘油对固定化酶有毒性，使固定化酶使用寿命短。

⏹第四节结束
⏹几个重要概念
⏹重要作用
⏹制备技术
⏹第四节结束
⏹点击返回。