蛋白质和多肽的氨基酸序列分析

虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 更精确、 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 方法出现，很多因素如温度、时间、 试剂、添加剂、 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 程度均有影响。 • 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
样品纯度必须>97%以上； 纯度必须>97%以上 1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 测定蛋白质的相对分子质量 相对分子质量； 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法， SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 测定蛋白质多肽链种类和数目 多肽链种类和数目； 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS种类： SDS-PAGE 数目： 末端氨基酸残基摩尔数/ 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 测定蛋白质的氨基酸组成 氨基酸组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数； 种氨基酸的个数；
• 1、酸性水解
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中 是最 通用的水解剂。 通用的水解剂。 • 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为 ～ 条件： 、真空、 ℃ 水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 • 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 和苏氨酸被部分水解，损失分别为 和 。
总之， 总之，蛋白质水解阶段所采用的方法 不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。 不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。 对于不同的蛋白质、不同的研究目的、 对于不同的蛋白质、不同的研究目的、以及 样品量的多少，应采取不同的水解方法。 样品量的多少，应采取不同的水解方法。
二、特殊氨基酸的保护
不同水解条件下， 不同水解条件下，各种氨基酸的回收 有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半 有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半 胱氨酸可能遭水解破坏 可能遭水解破坏， 胱氨酸可能遭水解破坏，导致无法正确测 定其含量。 定其含量。 因此水解过程中， 因此水解过程中，需要考虑对特殊氨 基酸的保护。 基酸的保护。
蛋白质测序的研究历史
1940年前 1940年前
采用部分水解的方法试图测定 蛋白质的氨基酸序列 Consden等利用色谱技术成功测 等利用色谱技术成功测 定了短杆菌肽S6的氨基酸序列 定了短杆菌肽 的氨基酸序列 Sanger首次测定了牛胰岛素的一级 首次测定了牛胰岛素的一级 结构（ 个氨基酸残基组成） 结构（由51个氨基酸残基组成） 个氨基酸残基组成 Spackman、Stein、Moore制造了自 、 、 制造了自 动化的氨基酸分析仪， 动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定 量分析进入了一个崭新的阶段 Edman 推出第一台自动测序仪
氨基酸组成分析的步骤 氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即： 个步骤， 个步骤
1
在一定温度、酸 在一定温度、 度等条件下， 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂， 键断裂，水解成 游离氨基酸。 游离氨基酸。
2
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
3
利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析。 色谱分析。
第十章
蛋白质和多肽的氨 基酸序列分析
引言
• 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在 75～200Da之间，其化学通式为：
• 在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生 物来源的多肽中出现D型氨基酸。
引言
• 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽 20 键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、 键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏 水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并 发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级 发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级 结构决定了蛋白质的高级结构及功能。 结构决定了蛋白质的高级结构及功能 • 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功 能研究中不可缺少的部分。
氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操 作微量化，但也给定量带来了困难， 定量带来了困难 作微量化，但也给定量带来了困难，一般 很难通过常规的称量或测蛋白溶液在 280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所 的光吸收值来准确定量蛋白质， 的光吸收值来准确定量蛋白质 以如果在蛋白质酶解或测序前， 以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质 样品的一部分进行氨基酸组成分析， 样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。
• 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小 是反应需要较长的时间，
的肽段，水解不完全。另外， 的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白 对样品的测定结果可能会有干扰。 质，对样品的测定结果可能会有干扰。
• 常见蛋白水解酶及其作用位点
• 4、微波辐射能水解 、
• 微波是一种高频电磁波， 微波是一种高频电磁波，其能量传递是 通过分子的极化， 通过分子的极化，而水分子的极化作用是非 常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水 常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水 解的时间大大缩短。 解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微 波辅助酶水解中， 波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十 小时缩短到几十分钟。 小时缩短到几十分钟。 • 因此， 因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现 大大提高了氨基酸组成分析的效率。 大大提高了氨基酸组成分析的效率。
• 2、碱性水解 、
• 碱性水解一般选用 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。 作为水解剂。 和 作为水解剂 例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮 例如将水解样品加入 中 气后填充管， 水解22h。 气后填充管，110 ℃水解 。 • 该水解方法是 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 水解的互补法。 水解的互补法 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨 酸以及半胱氨酸遭到破坏， 酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外 消旋化，仅色氨酸是稳定的。 消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限 于测定色氨酸的含量。 于测定色氨酸的含量。
• 3、酶水解
• 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏 一组蛋白酶水解肽链， 水解肽链 感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。 感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
• 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可 是水解过程中氨基酸不发生消旋化，
以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条 以保持所有的组成氨基酸不被破坏。 件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。 件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。
章节
第一节 氨基酸组成分析 第二节 蛋白质的末端测定 第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 亚基拆离、 肽段的氨基酸顺序测定 第四节 肽段的氨基酸顺序测定 第五节 蛋白质一级结构的重建
第一节 氨基酸组成分析
第一节 氨基酸组成分析
一、蛋白质或多肽的水解方法 二、特殊氨基酸的保护 三、衍生方法及原理 四、氨基酸定性和定量分析 五、测定氨基酸组成的实验步骤
1947
1955
1958
1967
引言
牛胰岛素的一级结构
引言
引言
一级结构测定的基本流程
1. 拆分蛋白质分子的多肽链 拆分蛋白质分子的多肽链 蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的 末端和 末端残基 鉴定多肽链的N-末端和 末端残基; 末端和C-末端残基 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解 多肽链裂解成较 小的片段; 小的片段 4. 对各肽段的氨基酸序列进行测序 对各肽段的氨基酸序列进行测序 测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构 重建完整多肽链的一级结构; 完整多肽链的一级结构 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置 二硫键的位置； 酰胺基位置的确定 位置的确定。 7. 酰胺基位置的确定。
• 相关措施：
• 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 对某些氨基酸的破坏率， 氨基酸的破坏率 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为 时， 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 脂肪族氨基酸残基间的肽键， • 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、Val有些脂肪族氨基酸残基间的肽键 、 Val、Ile-Val等之间的肽键难于裂解 Val、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 等之间的肽键难于裂解， 长水解时间如水解92h甚至 甚至120h来解决。但是长时 来解决。 长水解时间如水解 甚至 来解决 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。 • 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。
• 5、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析） 、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）
如果蛋白质样品采用电泳法(如 分离， 如果蛋白质样品采用电泳法 如SDS-PAGE)分离， 分离 很难从凝胶中洗脱下来， 很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移 聚偏氟乙烯)膜上 到PVDF (聚偏氟乙烯 膜上，然后在 聚偏氟乙烯 膜上，然后在PVDF膜上直接进 膜上直接进 行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位 原位(in 分析。 行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位 situ)分析。 分析 可将水解指管放入水解反应器中， 可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部 加入200ul含7％巯基乙酸的 盐酸， 加入 含 ％巯基乙酸的6mol/L盐酸，110 ℃真空水 盐酸 解24 h，水解结束后用 ，水解结束后用200 ul 含30％甲醇的 mol/L ％甲醇的0.1 盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便 膜中抽提出来， 盐酸反复三次将氨基酸从 膜中抽提出来 进行下一步的分析。 进行下一步的分析。
水解
衍生
色谱
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。 摩尔比。
一、蛋白质或多肽的水解方法
• 水解是蛋白质氨基酸组成分 水解是蛋白质氨基酸组成分 析的第一步， 析的第一步，作用是破坏蛋 白质的肽键，得到游离的氨 白质的肽键，得到游离的氨 基酸， 基酸，用于之后的定性定量 分析。 分析。 • 这是极其重要的一步，因为 这是极其重要的一步， 水解质量的好坏将直接影响 到最终分析结果的正确与否。 到最终分析结果的正确与否
另外， 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结 果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭 端封闭， 果的情况，一种可能是蛋白质的 端封闭，另 一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分 是非蛋白质物质， 是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基 酸组成外， 酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液 中的游离氨基酸。 中的游离氨基酸。