心肌细胞分离方法

成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序

溶液配方：

1.无钙台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节pH 7.35-7.4 ）

2.台式液（含5%CO2的氧气饱和30min,NaOH调节pH 7.35-7.4）

3.KB 液(含5%CO2 的氧气饱和30min,NaOH 调节pH 7.35-7.4)

4.酶液：（NaOH 调节pH 7.35）

4.1[李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]

100mL酶液A:胶原酶I +胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collage nasel +6mg 胰蛋白酶

45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenasel

4.2[王振国.四医大硕士论文。2005]

30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg胶原酶I +21mg BSA

5.复钙液（NaOH调节pH 7.35）

5.1

20mL 复钙液A: 20mL 无钙台式液+10mgCaCI2+20mg BSA。

20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCI2+20mg BSA。

20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。

5.2

100mL 复钙液A: 100mL 无钙台式液+1.1mgCaCI2, 100mg BSA。

100mL 复钙液B: 100mL 无钙台式液+5.5mgCaCI2, 100mg BSA。

50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。

5.1[李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007]

复钙液A:取无钙台式液加入CaCI2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL

复钙液B :取无钙台式液加入CaCl2至0.5mmol/L, BSA至1 mg/mL

复钙液C:取台式液加入BSA至1 mg/ mL。

6.心肌细胞分离

其步骤简述如下：

1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重）

2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中,使心脏剧烈收缩排出心腔内

残留的血液，然后迅速将心脏固定于Lan ge ndorff灌流系统上。

3.经主动脉灌流（37T ）含氧无钙台式液

4.心脏停跳后，换以含胶原酶I（ 0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙台式

液灌流约10min

5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶液约

2min。

6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB （37C）液中。

7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。

8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100X离心5min），保留沉淀并换入新

鲜含2%BSA的KB液。

9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8X 10-3mol/L （一说1.25X 10-3mol/L），得

到钙耐受心室肌细胞，保存于含1.8 X 10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。

另一说：

8.250目尼龙网过滤，静置10min,弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min （使心肌细胞自然沉降），弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C,静置15min备用。

9.暗室中负载Fura-2 AM Ca2+荧光探针染色，500此台式液加1让DMSO （二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上仪器检测。

注意事项：灌流消化过程中维持7.5~ 10.0 kPa的压力,所有液体均用0.22卩n滤器

过滤除菌且用体积分数95%的02+体积分数5%的CO2混合气体饱和，灌流温度保持在35C,实验室温度保持在20-30Eo