高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训(PPT 103页)
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱法
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
Leabharlann Baidu
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
对极性键合相来讲,一般键合表面的基团是 由三部组成:
键型 如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N。这是整个极 性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。
主体基团 一般由直链烃基或醚基所组成,其 作用为使在硅胶表面与特定的极性基团之 间保持一定距离。
极性的端基 由带极性基团(如NH2、OH)的 烃基或芳基所组成。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
在极性键合相上的分离机理,有吸附和分配之争。但 一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程,通过填 料表面极性基团的偶极诱导,或氢键,或静电作用和溶 质分子发生相互作用,达到混合物的分离目的。
离子交换键合相色谱
离子交换色谱早期都采用高分子聚合物(如苯乙烯 -二乙烯苯)为基质的离子交换树脂作固定相。在 高效液相色谱中,这种固定相由于溶胀性,不耐高压, 以及表面的微孔型结构影响传质速率,现已逐渐被 离子交换键合相所代替。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
离子性键合固定相的交换容量与固定相的
表面积直接有关。全多孔微粒型固定相的 交换容量，一般在毫克当量的水平；薄壳 型由于表面积较小,一般只有微克当量级。 交换容易可用酸碱滴定法测定。
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
（三）热稳定性好
这一点在气相色谱中很重要。每种固定液有最高 使用温度。例如十八烷作为固定液时,只能在常温 下使用,但十八烷基键合相的流失温度在200℃以 上。在HPLC中,热稳定必也有一定意义,因为某些 分离是升温条件下进行的。
（四）表面改性灵活,容易获得重复性的产品
改变键合用有机硅烷,可以得到不同键合相的填料, 以适用于各种类型的试样分离,有助于提高分离选 择性。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
第二节 化学健合相 色谱
在液相色谱中,液一液分配色谱,(liquidliquid chromatography,LLc)具有较高的分 离效能和温和的色谱条件。但最大的缺点 是担体表面涂渍的有机液相容易流失,并污 染分离后的组分。化学键合固定相是克服 这一主要缺点而产生的。它的出现,使得以 液-固吸附色谱和液-液分配色谱为主要操作 模式的液相柱色谱大量地被键合相色谱所 取代,某些离子型化合物也改用了离子交换 键合相或反相离子对色谱进行分离。因而, 化学键合相色谱是现代液相色谱中的一个 重要方法。
特点
（一）柱子不“娇”
化学键合相是借助于化学反应的方法,将有机分子 以共价键连接在色谱担体上。因此,在很大程度上 减弱了表面活性作用点,清除了某些可能的催化活 性,从而减少了复杂样品的表面上的不可逆化学吸 附,使得操作简化、峰形对称、对溶剂中微量水分 含量的变化要求不苛刻。此外,溶剂的残留效应小, 梯度冲洗平衡快,和液-固色谱相比较,流动相可用 价廉的甲醇-水混合液。
在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交 换基团,便成了离子交换键合相。若带上磺酸基(SO3H)、羧酸基(-COOH)就是阳离子交换剂，若 带上季铵基（-R4H+)或氨基（-NH2)就是阴离子 交换剂。
上述离子交换键合相,多以薄壳型或全多孔 微粒硅胶为基质,具有较高的耐压性、化学 与热稳定性。由于硅胶有好的机械强度,耐 压,这类微粒型键合固定相可以高压匀浆装 柱。但它对pH的适用范围只能在pH0～8。 pH>9硅胶便容易溶解。特别是未键合的残 留硅羟基容易生成硅酸盐。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
极性键合相色谱
极性键合相指键合有机分子中含有某种极性 基团。和空白硅胶相比,这种极性键合相表面上能 量分布相对均匀,因而吸附活性也比硅胶低，可以 看成是一种改性过的硅胶。最常见的极性键合相 有氰基（-CN，cyano-)、二醇基(diol)、氨基（NH2，amion-）等。商品键合相以上述基团命名, 如LiChrosorb NH2,LiChrosorb DiOl等。也有的 商品键合相并不注明是什么基团,而是称为Vydac polar(即氨基)或BondapaK Carbohydrate(也即氨 基)等。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
大多数情况下,极性键合相的制备分二步进
行。第一步是在硅胶表面先接上一个正烃 基或正芳基硅烷,然后再以相应的取代反应 引入极性基团。由于空间位阻的影响,上述
取代反应往往不能象均相溶液中反应那样 完全,一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程 度。
上述三种极性键合相都是主要以氢键力作
用,其中氰基是一种氢键接受体,而后二种兼
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
具氢键接受体和给予体两种性能。对于有 较强氢键作用力的样品,在后两种键合相上 所得的k’就大。如联苯胺和苯胺，在正相洗 脱的条件下,在氨基固定相上所得的k’比氰 基固定相显著增大。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。
（二）耐溶剂冲洗 这是传统的液-液分配色谱逐渐被键合相色谱 (bonded phase chromatography,BPC)取代的根本 原因。在现代液相色谱发展的初期,常和气相色谱 一样,把有限的几种固定液,例如β、β’-氧二丙腈、 聚乙二醇、角鲨烷等涂渍的担体表面上,用一种性 质相差很大的溶剂冲洗,进行LLC分离。由于两种 完全互不相溶的溶剂体系实际上几乎不存在,因而 在LLC中固定液相的流失就十分严重。为了克服 这个缺点,曾采用流动相预先被固定液饱和,以及柱 前增加预饱和柱的方法,但这样做既不方便,柱系统 的稳定性也差。化学键合相是通过化学反应将有 机分子键合到担体上,因而具有不可抽提性,也就是 不存在固定液流失问题,使得柱寿命大大延长,并且 扩大了可用溶剂的范围。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
Leabharlann Baidu
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
对极性键合相来讲,一般键合表面的基团是 由三部组成:
键型 如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N。这是整个极 性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。
主体基团 一般由直链烃基或醚基所组成,其 作用为使在硅胶表面与特定的极性基团之 间保持一定距离。
极性的端基 由带极性基团(如NH2、OH)的 烃基或芳基所组成。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
在极性键合相上的分离机理,有吸附和分配之争。但 一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程,通过填 料表面极性基团的偶极诱导,或氢键,或静电作用和溶 质分子发生相互作用,达到混合物的分离目的。
离子交换键合相色谱
离子交换色谱早期都采用高分子聚合物(如苯乙烯 -二乙烯苯)为基质的离子交换树脂作固定相。在 高效液相色谱中,这种固定相由于溶胀性,不耐高压, 以及表面的微孔型结构影响传质速率,现已逐渐被 离子交换键合相所代替。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
离子性键合固定相的交换容量与固定相的
表面积直接有关。全多孔微粒型固定相的 交换容量，一般在毫克当量的水平；薄壳 型由于表面积较小,一般只有微克当量级。 交换容易可用酸碱滴定法测定。
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
（三）热稳定性好
这一点在气相色谱中很重要。每种固定液有最高 使用温度。例如十八烷作为固定液时,只能在常温 下使用,但十八烷基键合相的流失温度在200℃以 上。在HPLC中,热稳定必也有一定意义,因为某些 分离是升温条件下进行的。
（四）表面改性灵活,容易获得重复性的产品
改变键合用有机硅烷,可以得到不同键合相的填料, 以适用于各种类型的试样分离,有助于提高分离选 择性。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
第二节 化学健合相 色谱
在液相色谱中,液一液分配色谱,(liquidliquid chromatography,LLc)具有较高的分 离效能和温和的色谱条件。但最大的缺点 是担体表面涂渍的有机液相容易流失,并污 染分离后的组分。化学键合固定相是克服 这一主要缺点而产生的。它的出现,使得以 液-固吸附色谱和液-液分配色谱为主要操作 模式的液相柱色谱大量地被键合相色谱所 取代,某些离子型化合物也改用了离子交换 键合相或反相离子对色谱进行分离。因而, 化学键合相色谱是现代液相色谱中的一个 重要方法。
特点
（一）柱子不“娇”
化学键合相是借助于化学反应的方法,将有机分子 以共价键连接在色谱担体上。因此,在很大程度上 减弱了表面活性作用点,清除了某些可能的催化活 性,从而减少了复杂样品的表面上的不可逆化学吸 附,使得操作简化、峰形对称、对溶剂中微量水分 含量的变化要求不苛刻。此外,溶剂的残留效应小, 梯度冲洗平衡快,和液-固色谱相比较,流动相可用 价廉的甲醇-水混合液。
在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交 换基团,便成了离子交换键合相。若带上磺酸基(SO3H)、羧酸基(-COOH)就是阳离子交换剂，若 带上季铵基（-R4H+)或氨基（-NH2)就是阴离子 交换剂。
上述离子交换键合相,多以薄壳型或全多孔 微粒硅胶为基质,具有较高的耐压性、化学 与热稳定性。由于硅胶有好的机械强度,耐 压,这类微粒型键合固定相可以高压匀浆装 柱。但它对pH的适用范围只能在pH0～8。 pH>9硅胶便容易溶解。特别是未键合的残 留硅羟基容易生成硅酸盐。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
极性键合相色谱
极性键合相指键合有机分子中含有某种极性 基团。和空白硅胶相比,这种极性键合相表面上能 量分布相对均匀,因而吸附活性也比硅胶低，可以 看成是一种改性过的硅胶。最常见的极性键合相 有氰基（-CN，cyano-)、二醇基(diol)、氨基（NH2，amion-）等。商品键合相以上述基团命名, 如LiChrosorb NH2,LiChrosorb DiOl等。也有的 商品键合相并不注明是什么基团,而是称为Vydac polar(即氨基)或BondapaK Carbohydrate(也即氨 基)等。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
大多数情况下,极性键合相的制备分二步进
行。第一步是在硅胶表面先接上一个正烃 基或正芳基硅烷,然后再以相应的取代反应 引入极性基团。由于空间位阻的影响,上述
取代反应往往不能象均相溶液中反应那样 完全,一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程 度。
上述三种极性键合相都是主要以氢键力作
用,其中氰基是一种氢键接受体,而后二种兼
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
具氢键接受体和给予体两种性能。对于有 较强氢键作用力的样品,在后两种键合相上 所得的k’就大。如联苯胺和苯胺，在正相洗 脱的条件下,在氨基固定相上所得的k’比氰 基固定相显著增大。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。
（二）耐溶剂冲洗 这是传统的液-液分配色谱逐渐被键合相色谱 (bonded phase chromatography,BPC)取代的根本 原因。在现代液相色谱发展的初期,常和气相色谱 一样,把有限的几种固定液,例如β、β’-氧二丙腈、 聚乙二醇、角鲨烷等涂渍的担体表面上,用一种性 质相差很大的溶剂冲洗,进行LLC分离。由于两种 完全互不相溶的溶剂体系实际上几乎不存在,因而 在LLC中固定液相的流失就十分严重。为了克服 这个缺点,曾采用流动相预先被固定液饱和,以及柱 前增加预饱和柱的方法,但这样做既不方便,柱系统 的稳定性也差。化学键合相是通过化学反应将有 机分子键合到担体上,因而具有不可抽提性,也就是 不存在固定液流失问题,使得柱寿命大大延长,并且 扩大了可用溶剂的范围。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减