胚胎体外培养及胚胎评估的培训2015122213END

温度
• 鼠胚
– 室温5分钟——降低卵裂率 – 15分钟——囊胚形成率减半
• 人卵母细胞——低温损害纺锤体
温度——纺锤体解聚与恢复
• 33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消 失37℃后, 10分钟内恢复 • 28℃，解聚加快，恢复时间长，20 分钟不能完全恢复
液滴/培养方式
• 单独培养
集合培养
• 胚胎自分泌、旁分泌作用 • 减小体积 • 适当增加胚胎数目
– 如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人 血浆蛋白粉、5%血浆蛋白注射液、及合成 血清替代品（sss）
油
• 阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化 • 种类：
– 矿物油 – 石蜡油
培养液储运
• 冷链运输，2~8℃ • 保持容器密封，有泄漏的容器导致培养 液碱化，镁离子沉淀 • 减少细菌污染风险
分装
每名全职胚胎学家完成250~400周期/年
人员及操作
• 操作时间 • 对卵、胚胎的应激 • 核对
胚胎体外培养 胚胎评估
• 卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致 • 减少移植胚胎数，挑选正确的胚胎！
• 胚胎评估、胚胎选择是IVF实验室技术 中的核心
常规胚胎形态学评估
始于第一例IVF-ET 1981年Edwards阐述了 形态学评估的方法
铵
• 氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致 胚胎毒性物质-铵离子的积累 • 铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因 表达 • 会严重降低移植后种植率及胎儿发育率
抗生素
• 培养基中一般均含抗生素例如青霉素、 链霉素和庆大霉素 • 主要作用时防止培养基的细菌污染
蛋白质/大分子物质
• 白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷， 避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且 可以抵消毒性效应
单一培养液？
• 单一培养：简化流程，形成率类似 • Day3换液 • Day3不换液！
pH值与缓冲物质
• pH：代表氢离子浓度 • pH与细胞各种生理功能关系极密切 • pH指示剂：酚红 缓冲物质：维持pH稳定，成对或一种 ：碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES
pH值
7
1
14
pH值与CO2浓度
• 最重要的缓冲对 • 碳酸盐缓冲对：HCO3-/H2CO2
剩余的0.001% 是什么？
低氧培养
• 高浓度氧，胚胎基因表达异常？
• 低氧培养改善体外胚胎发育
• 低氧培养，人囊胚细胞数增加
低氧培养
• 部分文献——不必要低氧? • 培养液内，添加了抗氧化物质（牛磺酸、 丙酮酸） • 可能消除高氧的不利影响
ASRM，2013年
支持低氧环境利于囊胚形成！
低氧同样利于卵裂期胚胎
2010
胚胎的形态学指标
胚胎形状 裂球数量 裂球形状 裂球排列 碎片 多核 颗粒 空泡 致密化
透明带 极体 卵周隙
原核
早卵裂
囊胚腔大小 ICM形状 TE细胞数
Right time， right embryo！
评估时间
观察内容 受精 Syngamy check 受精后时间 17 ± 1 h 23 ± 1 h 26 ± 1 h post-ICSI 28 ± 1 h post-IVF 44 ± 1 h 68 ± 1 h 92 ± 2 h 116 ± 2 h Expected stage of development Pronuclear stage Up to 50% in syngamy (up to 20% at the 2-cell stage) 2-cell stage 4-cell stage 8-cell stage Morula Blastocyst
[i] Alikani M. Hum Reprod 2000
碎片
• 碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞 浆结构（Alikani，1999） • 细胞代谢或分裂过程异常造成的凋亡过程 • 染色体异常造成碎片？
仅仅是目前我们对碎片的认识
“细胞”大小与DNA
• Day2胚胎，卵裂球65-70um
– 小于45um——2％有DNA – 大于45um —— 67％有DNA
原核期评分
Grade 1 Rating Description
Symmetrical Equivalent to Z1 and Z2
2 3
Other arrangements, Nonincluding peripherally-sited symmetrical pronuclei
Abnormal Pronuclei with 0 or 1 NPB
液滴
自分泌 旁分泌
集合培养——依据
• 鼠、羊、牛胚胎培养证据 • 具体旁分泌因子未确定
80 70
60
50 40 30
20
10 0 1 2 4
集合培养——方法
• 20～50ul • 2～5个胚胎/液滴 • 盖油（石蜡油、矿物油）
Байду номын сангаас
液滴
矿物油 液滴
液滴
集合培养
缺点：不利于单个胚胎的连续观察
解决1：按Day3形态学评分分组培养
相对湿度（RH）
RH=绝对湿度/饱和湿度
RH=33.3% RH=43.5%
理想的室内相对湿度？
抑制霉菌 设备
人员
减少液体蒸发
0
30~60%
100
培养箱内环境
• • • • • • 气体 温度 培养皿 液滴 培养方式 油
气体
二氧化碳培养箱
三气培养箱 桌面式培养箱
气体纯度
• 99.99%? • 99.995%? • 99.999%?
12 10 8 6 4 2 0
mmol/L
序贯培养
丙酮酸
乳酸
葡萄糖
输卵管
子宫腔
Gardner,1998
序贯培养
• 葡萄糖
– 不利于分裂期胚胎发育 – 囊胚主要能量来源
• EDTA
– 利于分裂期胚胎发育 – 抑制囊胚内细胞团发育
• 氨基酸
序贯培养系统
• Day1~Day3:卵裂期培养液 • Day3~Day6：囊胚培养液
胚胎形态学评估
• 多种评分体系可进行胚胎形态学评估 • 缺点
– 依赖操作者主观能力
• 优势
– 快速而有效
Alpha
objectives
“To advance the art and science of clinical embryology for the benefit of the public worldwide, through international promotion of education, communication, and collaboration.”
世界卫生组织(WHO,1989)
VOC分类
• • • • 苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯） 二异氰酸酯（TDI） 二异氰甲苯酯 有机氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三 氯乙烷） • 氟里昂类 • 石油烃类 • 有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等
测定VOC
• • • • 先俘获、后测定 各种VOC的俘获方法不同 测定总VOC？ 目前测定的“TVOC”：6~13个碳原子 的苯系有机物 • 其他VOC有各自的俘获测定方法
• • • • 目的：减少开瓶次数 分装量：根据使用情况，一次一支 分装容器，与量匹配 标记分装日期
胚胎移植－移植时期
• 广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植 • 在体内此时的胚胎是在输卵管内，而不是在 子宫内 • 卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植
囊胚培养
• • • • 进一步筛选胚胎 灵活的移植时间 便于PGD/PGS 减少异位妊娠
早卵裂
• 24～27小时的第一次分裂 • Shoukir，1997年提出早卵裂是发育能力 的重要标志 • 后多人研究证实
Day2卵裂期评分
• 分裂对称性
• 卵裂球均等性
Day3 细胞数
• Edwards提出人早期胚胎 有相对固定的发育速度 • 超出或低于此速度，均影 响后续发育 • 大量文献：细胞数——种 植率、囊胚形成率！
• • • • 荟萃分析，随机对照研究 1382 名IVF/ICSI患者 20% vs 5% O2 活产率从32%提高到43%
Low oxygen concentrations for embryo culture in assisted reproductive technologies Stephan Bontekoe1,*, Eleni Mantikou1, Madelon van Wely1, Published Online: 11 JUL 2012 Assessed as up-to-date: 4 NOV 2011 DOI: 10.1002/14651858.CD008950.pub2
未知VOC很难测定
尘埃粒子
• • • • 直径>0.5um的悬浮粒子 十万级：3500000/m3 万级：350000/m3 千级：35000/m3
光照
• 来源：室内照明灯、显微镜光源 • 危害：
– 损害线粒体 – 培养液成分分解 – 紫外线产生活性氧，对所有细胞有害
光照
• 豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和 有丝分裂 • 低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠 • 有相反的结论——兔卵进行光照20～30 分钟后，随后的受精率和着床率并未受 到明显影响
唯一由资深胚胎学家组成的国际组织
Alpha 共识
• embryo morphology • cryopreservation KPIs • The Professional Status of the Clinical Embryologist
Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceeding of an expert meeting
多核现象
• • • • 可能与染色体异常有关 囊胚形成率下降 种植率下降 妊娠率下降
35 30 25 20 15 有多核 无多核
• Van Royen，2003 • Magli，2007
10 5 0 囊胚形成率
Day3 胚胎形态学评价
细胞数与碎片含量，哪个指标更重要 ？
在所有形态学指标中，细胞数是 最重要的独立的预测胚胎活性的 指标！ Ronit Machtinger，2013
8细胞 碎片0～10％
8细胞 碎片20～40％
6细胞 碎片20～50％
解决2： 特殊培养皿
液滴
培养液
• • • • • • • • • • 培养液种类 水、离子 碳水化合物 氨基酸 pH值及缓冲物质 维生素，抗生素 螯合剂 抗氧化物质 蛋白质，大分子 激素，生长因子
培养液种类
• 序贯培养液 • 单一培养液
早卵裂 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5
原核期评分
• • • • 1998年前后提出 原核核仁的数量，排列 原核大小及排列 胞浆状态
• 2001年,原核期评分能够预测囊胚形成，与妊娠率相关 • 近10余年一直存在争议，研究多为回顾性 • 2011年time-lapse：对评分方法提出质疑
胚胎体外培养 及胚胎评估的培训
孙正怡 2015-12-22
胚胎体外培养 胚胎评估
胚胎体外培养体系
培养箱外环境
空气、振动、光照 …
人员/操作 培养流程
培养箱内环境
气体、 湿度、培养 皿、油…
培养液
培养箱外环境
• • • • 空气及污染物 振动、噪音 光照 室内湿度
挥发性有机化合物VOC
总挥发性有机化合物（TVOC）： 熔点低于室温 沸点50～260℃ 挥发性有机化合物的总称
培养系统的pH值
– 7.2-7.4 – 碳酸盐体系不稳定！
• 暴露空气会使PH迅速升高 • 盖油减少培养基气体交换
CO2浓度影响因素
• 设定值：5%？6% • 传感器类型 • 培养箱开门方式
• 温度、湿度
无机离子
• 无机离子参与渗透压形成 • 高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成 • 胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细 胞内稳态调节能力有关 • 磷在含有葡萄糖的简单培养基例如HTF 或Earl’s抑制人胚胎的发育
• Day3胚胎，卵裂球55-60um
– 小于40um——3％有DNA – 大于40um —— 66％有DNA
碎片对胚胎发育的后续影响—— 局部融合
• Day4可能发 生局部融合 • 部分卵裂球和 碎片排除在外
局部融合——囊胚质量下降
卵裂球对称性
• 文献非常少 • 卵裂球严重不均匀的胚胎种植率下降 • Hardarson，2001
囊胚的整倍体率
70
60 50
年龄与囊胚的整倍体率
40
30 20
10
0
年龄
<35
35~37
38~40
41~42
>42
Baris Ata 2012
人员及操作
• 人员数量适当 • 每项关键技术均至少2人能熟练实施 • 确保足够人力实现双人复核
卫生部（卫科教[2003]176号文件）规定，实 验室专业技术人员不得少于3人。年周期超过 1000个周期的中心需要适当增加技术人员