诊断试验对非梗阻性无精症患者AMH检测应用价值的评估_黄永富

诊断试验对非梗阻性无精症患者 AMH 检测应用价值的评估
黄永富1 ， 张 峰2 （ 1． 扬州大学第四临床医学院 南通瑞慈医院检验医学中心， 江苏 南通 226010； 2． 南通市通州区人民医院检验科，江苏 南通 226300）
摘要： 目的 为非梗阻性无精子症（ NOA） 患者筛选出诊断效率高的精子生成标志物，并寻找提高睾丸精子 生成标志物诊断效率的有效途径。方法 选取正常生育、梗阻性无精子症（ OA） 和 NOA 3 组男性为研究对象， 采用酶联免疫和固相化学发光免疫法测定 3 组男性精浆中的抗缪勒管激素 （ AMH） 浓度、血清 促 卵 泡 激 素 （ FSH） 和睾酮（ T） 浓度，采用经阴囊 B 超声检查法测量睾丸体积（ TV） ，比较这些指标预测 NOA 患者睾丸精子获 取术（ TESE） 成功与否的性能差异。结果 精浆 AMH 在区分 NOA 患者 TESE 成功与否的准确性、可靠性和诊断 价值上均比血清 FSH 和 TV 好； 血清 T 的准确性、可靠性和诊断价值均较差； 与精浆 AMH 比较，联合参数的准确 性、可靠性和诊断价值均有所提高，但差异无统计学意义 （ P ＞ 0． 05） 。同样，通过各指标的受试者工作特征 （ ＲOC） 曲线下面积比较，精浆 AMH 用于预测 TESE 成功可能性比血清 FSH、T 和 TV 的预测价值更高； 联合参数 比单项参数的预测价值更高。结论 精浆 AMH 浓度是一种非侵入性 NOA 患者持久的精子发生过少的标志物； 通过使用联合参数，精浆 AMH 区分 NOA 患者 TESE 成功与否的准确性、可靠性和诊断价值均有所提高。
TESE 阴性 14 13． 47（ 10． 00 ～ 25． 00） 13． 21（ 8． 00 ～ 25． 00） 16． 76（ 6． 80 ～ 49． 00） * # 4． 36（ 2． 00 ～ 6． 65） 12． 23（ 7． 60 ～ 18． 60） * # 12． 33（ 2． 25 ～ 27． 60） *
OA 组
12 20． 00（ 15． 00 ～ 20． 00） 12． 00（ 15． 00 ～ 20． 00） 7． 62（ 5． 25 ～ 20． 42） 4． 30（ 2． 84 ～ 6． 59） ＜ 3． 20（ － ～ － ） *
16． 35（ 12． 06 ～ 19． 68） *
正常生育组 20 20． 00（ 15． 00 ～ 25． 00） 20． 00（ 15． 00 ～ 25． 00） 6． 54（ 4． 17 ～ 16． 15） 4． 35（ 2． 89 ～ 6． 73） 149． 00（ 9． 28 ～ 529． 90） 142． 01（ 20． 47 ～ 545． 29）
结果
一、NOA 组、OA 组及正常生育组 TV、血清生 殖激素、精浆 AMH 浓度的比较
NOA 组、OA 组及正常生育组血清 FSH、T 及 TV、精浆 AMH 结果见表 1。
表 1 3 组受试者的 TV，血清 FSH、T，精浆 AMH 结果的分布范围
［M（ P2． 5 ～ P97． 5） ］
组别 例数
左侧
TV（ mL）
右侧
FSH（ μg / L）
T（ IU / L）
AMH（ pmol / L）
联合参数
NOA 组 24 12． 00（ 10． 00 ～ 22． 25） 12． 00（ 3． 88 ～ 22． 13） 12． 00（ 2． 55 ～ 40． 95） * 4． 30（ 1． 71 ～ 6． 71） 18． 60（ 7． 85 ～ 59． 85） * # 16． 30（ 4． 26 ～ 58． 54） *
作者简介： 黄永富，男，1971 年生，硕士，副主任医师，主要从事生殖医学和临床检验诊断学研究。
检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 Laboratory Medicine，May 2014，Vol 29． No 5．
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腹上午 8∶ 00 至 10∶ 00 的前臂浅静脉血 5 mL，离 心后分离血清，在 8 h 内测定 FSH 和 T 浓度； （ 2） 精液采集： 研究对象均禁欲 2 ～ 7 d，手淫取精于 无菌容器中，37 ℃ 水浴箱中孵育，于射精后 1 h 内 取部分精液样本 3000 × g 离心 5 min ，精浆分装 到密封管内并迅速于 － 80 ℃ 冷冻箱中保存，30 d 内测定 AMH 浓度； （ 3） 睾丸组织采集： 局麻下以 常规方法进行 TESE 和睾丸活检术。
四、统计学方法 采用 Analyze-it 2． 22 软件进行统计分析。数 据呈偏态分布，以中位数（ M） ［第 2． 5 百分位数 （ P2． 5 ） ～ 第 97． 5 百 分 位 数 （ P97． 5） ］表 示，采 用 Mann-Whitney 非 参 数 U 检 验 对 不 同 组 间 进 行 AMH、FSH、T 和 TV 的比较，P ＜ 0． 05 为差异有统 计学意义。运用该软件绘制受试者工作特征（ receiver operating characteristic，ＲOC） 曲线图 / 曲线决 定图，对 NOA 患者进行各试验指标最佳诊断阈值 的确定、ＲOC 曲线下面积（ area under ＲOC curve， AUC） 的比较以及各试验指标诊断性能的评估。使 用三元一次回归方程计算联合参数，联合参数 = TV（ mL） + 精浆 AMH（ pmol / L） － FSH /4 （ IU / L） 。
TESE 阳性 10 14． 36（ 10． 00 ～ 20． 00） 13． 31（ 3． 00 ～ 20． 00） 7． 67（ 0． 72 ～ 21． 00） △ 3． 75（ 1． 32 ～ 6． 80） 25． 74（ 8． 60 ～ 68． 60） * #△△33． 26（ 8． 50 ～ 73． 70） ＊△△
关键词： 抗缪勒管激素； 非梗阻性无精子症； 精浆标志物； 精子生成； 睾丸精子获取术
抗 缪 勒 管 激 素 （ human anti-mullerian hormone，AMH） 是由睾丸支持细胞分泌的糖蛋白二 聚体，有控制睾丸间质细胞增殖和类固醇类激素 合成的功能，可能与生殖细胞增殖有关［1-3Fra Baidu bibliotek。我们 测定并分析了正常生育组、梗阻性无精子症（ obstructive azoospermia，OA） 组和非梗阻性无精子症 （ non-obstructive azoospermia，NOA） 组 3 组男性精 浆中 AMH 的浓度，以期判定其是否可作为不育 症患者精子发生的标志物和是否可以作为 NOA 患者睾丸精子获取术（ testicular sperm extraction， TESE） 成功与否的预测指标。
二、仪器与试剂 1． 仪器 Biotek ELX 808 酶 标 仪 和 Biotek ELX 50 洗板机（ 美国伯腾仪器有限公司） ； IMMULITE 2000 全自动化学发光免疫分析仪 （ 美国西 门子医学诊断产品有限公司） ，WLJY-9000 型计 算机辅助精子分析系统（ 北京伟力公司） 。 2． 试剂 血清促卵泡激素 （ follicle stimulating hormone，FSH） 和睾酮（ testosterone，T） 测定试 剂盒（ 批号分别为 2309 和 2465） 由美国西门子医 学诊断产品（ 上海） 有限公司提供。精浆或血清 AMH 测定试剂盒 （ 批 号 20120506 ） 由 美 国 Ｒ＆D Systems 公司提供。WJY-9000 型计算机辅助精子 分析 系 统 精 液 常 规 分 析 配 套 试 剂 （ 批 号 20120308） 由北京伟力公司提供。 三、方法 1． 样本采集 （ 1） 血样采集： 研究对象取空
NOA 患者，包括原因不明的 NOA 患者 10 例，睾 丸接受放化疗者 5 例，隐睾症者 3 例，精索静脉曲 张者 2 例，左睾丸切除者 1 例，病毒性睾丸炎者 1 例，腹股沟疝者 1 例，颅咽管瘤术后所致的垂体前 叶功能低下者 1 例，年龄（ 33 ± 3） 岁。3 组受试对 象的年龄比较差异无统计学意义（ P ＞ 0． 05） ，具 有一定的可比性。
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文章编号： 1673-8640（ 2014） 05-0556-05
检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 Laboratory Medicine，May 2014，Vol 29． No 5．
中图分类号： Ｒ446． 6
文献标志码： A DOI： 10． 3969 / j． issn． 1673-8640． 2014． 05． 028
2． 检测方法 待精液液化后，按世界卫生组 织《人类精液检查与处理实验室手册》（ 第 5 版） 中标准进行精液常规分析。FSH 和 T 测定采用 固相化学发光免疫法。FSH、T 的最低检测限分 别为 0． 10 IU / L、0． 14 nmol / L，检测 范 围 分 别 为 0． 1 ～ 170 U / L 、0． 20 ～ 15． 86 nmol / L，批内变异系 数（ coefficient of variation，CV ） 分 别 为 4． 20% 、 3． 38% ，批间 CV 分 别 为 6． 30% 、3． 75% 。AMH 水平应用双抗体酶联免疫吸附试验双份重复 测定。使用人纯化重组 AMH 来构建检测方法 的标 准 曲 线。 最 低 检 测 限 为 3 ． 20 pmol / L，测 试 范 围 为 3 ． 20 ～ 1 071 pmol / L，批 内 CV 为 8 % ，批间 CV 为 10 % 。
3． 睾丸体积（ testicular volume，TV） 测量 用 经阴囊 B 超声检查法进行 TV 测量。TV 以 Lambert 公式计算： 体积（ mL） = 睾丸上下径 × 左右径 × 前后径 × 0． 71。
4． TESE 和 睾 丸 病 理 学 检 查 在 局 麻 下 TESE 应与睾丸活检同时进行。取较大侧睾丸，局 麻后常规切开至睾丸白膜，避开白膜下血管，睾丸 中部切开白膜 0． 5 ～ 1． 0 cm，用外科剪刀切开并 分离，取约 25 ～ 50 mg 睾丸组织，将其中 25 mg 睾 丸组 织 放 入 3 mL HTF-HEPES 培 养 液 （ Irvine Scientific，Santa Anna，CA，美国） 中，将其在培 养
材料和方法
一、研究对象 在获取知情同意后，收集 3 组年轻男性的精 浆样本，年龄（ 33 ± 3） 岁。根据 2010 年世界卫生 组织的标准，正常生育组 20 名，年龄（ 32 ± 3） 岁。 OA 组和 NOA 组均为 2009 至 2012 年期间在南通 瑞慈医院不育症门诊就诊的不育症患者。OA 组 共 12 例，包括输精管发育不全患者 4 例、行输精 管切除术者 5 例、输精管梗阻者 2 例和射精管梗 阻者 1 例，年龄（ 33 ± 3） 岁。NOA 组 24 例，为各 种睾 丸 生 精 功 能 不 足 而 核 型 正 常 （ 46，XY） 的
注： － 表示无法获得相关数据； 与正常生育组比较，* P ＜ 0． 001； 与 OA 组比较，#P ＜ 0． 001； 与 TESE 阴性组比较，△P ＜ 0． 05、△△P ＜ 0． 01
皿底部的井字划痕上来回搓动以磨碎曲细精管， 组织悬液离心 10 min 后弃上清，加 0． 2 mL HTFHEPES。获得的组织悬液作 10 μL 长滴 5 个，盖 以石蜡油，200 倍倒置显微镜检查精子。剩余约 25 mg 送病理检查，睾丸活检组织在 Bouin 浸泡液 中固定，在石蜡中包埋，切片经苏木精曙红染色， 寻找精子生成的证据。根据莱文标准将精子生成 分为以下 4 类： 生精功能正常、生殖细胞发育不全 或精子生成减少、完全性或不完全性生精阻滞、完 全性或不完全性生殖细胞发育不全（ 唯 Sertoli 细 胞综合征） 和曲精小管硬化症。对不同部位每个 活检组织的连续切片进行研究，定性分析 ＞ 15 个曲精小管。