有机小分子荧光探针的研究49页PPT
有机小分子探针
有机小分子探针黄美英 2014010714摘要细胞内生物活性化合物在细胞内作用靶点的确定是化学生物学和药物开发中的关键问题之一。
作为功能蛋白质组学中的一项重要技术, 小分子探针在确定生物活性化合物细胞内作用靶点的研究中扮演着举足轻重的角色。
PH值在生理及病理过程如受体介导的信号传导、酶活性、细胞生长和凋亡、离子运输和稳态调节、钙含量调节、细胞内吞作用、趋化作用、细胞粘附和肿瘤生长等过程中起到非常重要的作用。
本文介绍了几种小分子探针原理，技术和方法，并通过列举近年来该技术应用的成功示例进一步阐明小分子生物活性探针技术的应用原理和重要性。
关键词生物活性化合物；小分子探针；PH值；DNA探针技术一绪论荧光探针是化学传感技术领域在上个世纪八十年代的一项重大发现，目前己有愈来愈多的荧光探针应用于分子水平上进行实时检测。
荧光检测技术由于灵敏度高，操作简便，可视性强，且对细胞、生物体的损伤小，成为了用于临床分析、环境监测、生物分析及生命科学等领域不可缺少的检测工具[1]。
分子荧光探针的检测对象包括各种离子、小分子、自由基、多肽、酶，甚至还包括温度、极性、粘度等。
人们可以使用荧光显微镜、荧光光谱仪、流式细胞仪、荧光活体成像系统等仪器获取荧光探针检测的相关信息，借助荧光成像技术我们能够实时检测活细胞内分子或离子的浓度以及生物大分子结构的变化过程，也可以获得关于生物组织生理代谢过程的相关信息，还可以实现生物活体的荧光成像[2]。
另一方面研究者们能够根据需要设计合成出满足“特定要求”的探针分子，基于此，荧光探针和荧光检测技术在生命科学的发展中起到举足轻重的作用[3]。
通常一个光探针分子由荧光团（Fluorophore）和识别基团（Receptor）通过连接臂（Spacer）以共价键方式连接，荧光团作为信号转换器将识别行为转化为光信号，可以通过荧光的增强或淬灭乃至光谱位移的变化对分析物进行识别。
荧光探针分子具有非常大的可塑性和应用潜力，通过对有机分子结构进行巧妙设计和改造，就能够设计合成出满足各种需要的荧光探针。
荧光探针 ppt课件
实验结论
RA荧光探针有如下优点：
①
灵敏度高、 选择性好
②
其荧光发射 波长在可见 区，用在细 胞中可避免 细胞自身荧 光和背景散 射的影响。
③
激发波长所 需的能量较 低,避免了高 能量的激发 波长对细胞 造成的潜在 伤害
。
④
在水溶液中 检测Cu2+的 有效pH范围 宽。
欢
迎 提
问
Thyoaunk
End
0 1
研究背景
检测原理
0 2
0 3
实验部分
实验结论
0
4
研究背景
Cu2 +
Cu2 + 生物体中基本的微量元素一; 生物体内过量摄入的铜也会产 生毒性; 采用荧光探针的方法检测铜离 子，尤其是跟踪其在化学反应 和生命活动中的作用过程具有 重要的意义．
检测原理
背景知识---荧光探针
• 典型的荧光探针由识别基团(受体)，荧光团和连接二者的 连接基团所组成。受体和底物结合后,导致受体分子光物理性 质的变化,具体表现为荧光团部分发生突光猝灭或增强。
实验部分
二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响
可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探 针RA之间相互作用不明显，体系的荧 光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比 在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+ 进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O 的体积比为1：1时，荧光强度已接近 最大；再增加乙腈的含量，虽然体系 的荧光强度未降低，但增加有机试剂 的用量对环境和生物体系的测试均不 利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1： 1进行测试。
Cu2+浓度逐渐增大，RA的荧光 强度大幅度增加，最大发射波长 由565 nm红移到571 nm，也证 明了探针分子发生了开环，形成 了共轭体系较大的荧光体系。
荧光探针的应用与进展课件
环境监测
污染物检测
荧光探针可以用于检测水体、土 壤等环境中的有害物质，如重金 属、有机污染物等，为环境污染 治理和生态保护提供技术支持。
生物毒性测试
荧光探针可以用来评估化学物质 对生物体的毒性作用，通过观察 荧光信号的变化，快速、准确地
评估环境中有害物质的风险。
生态研究
利用荧光探针标记生物个体或种 群，通过观察荧光信号的分布和 动态变化，研究生物在生态系统
开发适用于环境监测和食品安全检测的荧光探针，保障人类健康和 生态安全。
加强荧光探针的基础研究与人才培养
基础研究投入
加大对荧光探针基础研究的投入 ，支持科研团队开展创新性研究 ，推动荧光探针技术的持续发展 。
人才培养与交流
加强荧光探针领域的人才培养和 学术交流，鼓励跨学科合作与交 流，促进荧光探针技术的普及和 应用。
荧光探针与其他技术的结合应用
总结词
荧光探针与其他技术的结合应用是荧光探针领域的重 要发展方向，通过将荧光探针与其他技术相结合，可 以实现更高效、更准确的检测和诊断。
详细描述
随着各种技术的不断发展，研究者们将荧光探针与其 他技术相结合，如光学成像技术、质谱技术、纳米技 术等。这些技术的结合可以充分发挥各自的优势，提 高荧光探针的应用范围和效果。例如，将荧光探针与 光学成像技术相结合，可以实现生物体内的高清成像 和可视化检测；将荧光探针与质谱技术相结合，可以 实现蛋白质组学和代谢组学的高灵敏度检测。
荧光探针的分类
总结词
荧光探针可以根据激发波长、发射波长、荧光染料类型等进 行分类。
详细描述
根据激发波长，荧光探针可以分为紫外激发和可见光激发两 类；根据发射波长，可以分为长波长发射和短波长发射两类 ；根据荧光染料类型，可以分为荧光染料、荧光量子点、荧 光蛋白等类型。
taqman探针原理 ppt课件
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2021/3/26
taqman探针原理 ppt课件
1
是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探 针，荧光基团探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性 的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收；PCR扩增Taq酶的5'－3'外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧 光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实 现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常 用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型 TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析， 又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和
第十三章-荧光分析法PPT课件
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
有机小分子荧光探针的研究
有机小分子荧光探针可用于化学计量 学分析，如光度法、光谱法等，有助 于化学分析的准确性和灵敏度提升。
化学反应监测
通过荧光探针标记，可以实时监测化 学反应的进程和产物，有助于化学反 应机理的研究和优化。
04
有机小分子荧光探针的未来发展
新材料与新性能的开发
新型荧光染料
01
研究开发具有优异荧光性能的新型荧光染料，以提高荧光探针
药物筛选
通过荧光探针标记，可以 追踪药物在体内的分布和 作用，有助于药物设计和 筛选。
生物分析
有机小分子荧光探针可用 于检测生物分子，如蛋白 质、核酸等，有助于生物 分析、诊断和疾病监测。
在环境监测领域的应用
污染物检测
有机小分子荧光探针可用 于检测水体、土壤等环境 中的有害物质，有助于环 境污染的监测和治理。
荧光探针的分类
根据响应性质
可分为化学和生物荧光探针。化学荧光探针主要响应化学刺激，如pH、离子、 氧化还原物质等；生物荧光探针主要响应生物分子，如蛋白质、核酸等。
根据应用领域
可分为生物医学荧光探针、化学荧光探针和环境荧光探针。生物医学荧光探针 用于生物体内和细胞水平的检测；化学荧光探针用于分析化学中的各种检测； 环境荧光探针用于环境监测和污染物检测。
详细描述
有机小分子荧光探针在生物体内的稳定性受到多种因素的影响，如pH值、温度、光照射等。这些因素可能导致 荧光探针的结构发生变化，从而影响其荧光性能和稳定性。为了解决这一问题，研究者们尝试通过改进荧光探针 的结构和合成方法，提高其在生物体内的稳定性。
选择性问题
总结词
选择性问题是荧光探针面临的另一个挑战，主要表现在荧光探针的选择性不高，容易与 其他物质发生交叉反应。
荧光探针的应用与进展PPT课件
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
结论 利用所合成制备的两种不同的Polymer-Py/γ-CD主客体复合物， 实现了对四种不同蛋白样品的特异性识别检测。不同的聚合物链与不 同的蛋白的结合常数不同，因而所构建的聚合物基质荧光探针对蛋白 具有良好的选择性。而通过调节聚合物链的长度，还可进一步调节蛋 白识别检测的灵敏度和选择性。 这个方法不但制备简单、普适性强，而且具有较高的荧光检测灵敏度 和较强的蛋白识别选择性，为构建新型聚合物基质的主客体复合物荧 光探针的制备及蛋白识别分析提供了新的研究思路。
Analytical Chemistry（Anal. Chem., 2016, 88,1821-1826）
荧光探针的应用进展
Simultaneous Near-Infrared and Two-Photon In Vivo Imaging of H2O2 Using a Ratiometric Fluorescent Probe based on the Unique Oxidative Rearrangement of Oxonium 利用比率荧光探针实现在体内对H2O2的近红外和双光子成像
给电子取代基如：-NH2，-NR2，OH，-OR和-CN。 吸电子取代基如：-C = O，COOH，-CHO，-NO2和-
外因
溶液的PH值、温度 激发光源的选择 溶剂的性质如极性、介 电常数 染料分子间相互作用等
荧光探针的选择原则
（1）荧光的定性或定量 定性一般选择单波长激发探针，定量最好选择双波长激发的比率探针 （2）荧光探针的特异性和毒性 （3）荧光探针的适用PH （4）激发波长与发射波长 斯托克斯位移 （5）荧光强度与荧光寿命 （6）光稳定性、漂白性 （7）荧光量子产率
荧光探针PPT课件
荧光探针
1
.
什么是荧光探针？
荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长 光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实 现对被检测物质的定性或者定量分析。
荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射 发生变化，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中 存在的某种特定信息。
2
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荧光探针的优点
12
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Thanks for attention
13
7
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分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。它包 括一个环，环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成； 干为两列互补的碱基序列，在分子信标中，荧光基团 共价地连接在其干部分的一个末端，猝灭基团也靠共 价键连接在干部分的另一末端。
8
.
分子信标未与靶分子结合时，由于干部分两列互 补碱基对之间的氢键连接，使得荧光基团与猝灭基团 距离很近，荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧 光猝灭；当分子信标与序列互补的靶分子结合时，环 与靶序列杂交而形成了比干部分更长更稳定的碱基对 氢键连接，分子信标发生构型的变化，干部分被打开， 从而使荧光基团远离猝灭基团，荧光基团产生的荧光 得到几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中 靶标的量成正比。
Fluorephore Spacer hv
F
S
Receptor R
Analyte
.
strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
4
.
荧光基团和识别基团二者连接在同一个共轭体系中，荧 光基团是该体系中最基本的组成部分，一般为芳香族的 稠环化合物，其目的是将分子识别转换成不同形式的荧 光信号，如荧光强度的增强或减弱、荧光寿命的变化、 光谱的移动等。识别基团是为了实现这一选择性识别而 合成的探针结构单元，是决定荧光分子探针和被检测体 结合的灵敏度与选择性的部分，通常也称为受体。
第十一章荧光分析法PPT学习教案
会计学
1
2021/8/18
荧 光 分 析 法 ：是基 于被测 物质的 荧光谱 线位置 及其强 度进行 的 分 析 方 法 （属于 发射光 谱法） 。 应 用 对 象 ： 一般是 能产生 强荧光 的分子 或某些 特定离 子 本章重点： （ 1） 分 子 荧 光产生 的过程 （2） 荧光与 分子结 构关系 （ 3） 分 子 荧 光定量 方法
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S 为 电 子 自旋 量子数 的代数 和(要 么为0要 么为1 )； S = 0 时 M=1， 此时电 子所处 的能态 为单重 态用符 号S表示 。 S = 1 时 M=3， 此时电 子所处 的能态 为三重 态用符 号T表 示。 平 行 自 旋 比 成对自 旋稳定 (洪特规 则)， 三重态 能级比 相应单 重态能 级低； 大多数 有机分 子的基 态处于 单重态 用S0表 示；
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2021/8/18
它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质 沾污的荧光化合物的直接测定。（3）采用试剂空白则更好 一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样 溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂 质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（4）但这两 种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有 时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合 物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于 真实的空白溶液。如测VB2时用连二亚硫酸钠Na2S2O4
kEC
kP
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第14页/共37页
2.有机化合物分子结构与荧光关系
（ 1） 跃 迁 类 型：* → 的 荧 光效 率高， 系间跨 越过程 的速率 常数小 ，有利 于荧光 的产生 ； （ 2） 共 轭 效 应：提 高共轭 度有利 于增加 荧光效 率并产 生红移 （ 3） 刚 性 平 面结构 ：可降 低分子 振动， 减少与 溶剂的 相互作 用，故 具有很 强的荧 光。如 荧光素 和酚酞 有相似 结构， 荧光素 有很强 的荧光 ，酚酞 却没有 。 （ 4） 取 代 基 效应： 给电子 基 如 － NH2、 － OH、 － OCH3 使 荧 光 增 强 ，波长 长移； 吸 电 子 基 如 － NO2、 －F、－ Cl 使 荧 光 减 弱 或熄灭 。
有机小分子的荧光探针设计与应用论文素材
有机小分子的荧光探针设计与应用论文素材一、引言有机小分子作为一类重要的化学物质，在荧光探针设计与应用领域具有广泛的应用潜力。
本论文旨在探讨有机小分子荧光探针的设计原理与应用案例。
二、有机小分子荧光探针设计原理1. 荧光基团选择有机小分子荧光探针的设计首先需要选择适合的荧光基团。
荧光基团应具备强荧光信号和良好的荧光性能，如荧光寿命长、荧光发射波长可调等。
2. 结构优化为了提高荧光探针的性能，可以通过在荧光基团上引入特定的官能团，进一步调控其荧光性质。
例如，引入供体-受体结构，增强荧光基团的电子转移效率，从而提高荧光强度和稳定性。
3. 溶剂效应考虑溶剂对荧光探针的荧光性能有明显影响。
因此，在设计荧光探针时需要考虑溶剂效应，选择适合的溶剂或构造具有溶剂敏感性的探针，以实现对目标物的响应。
三、有机小分子荧光探针的应用案例1. 生物医学应用有机小分子荧光探针在生物医学领域具有广泛的应用前景。
例如，利用有机小分子荧光探针可以实现对特定生物标志物的高灵敏度检测，用于疾病诊断和治疗过程的监测。
2. 环境监测有机小分子荧光探针也可以应用于环境监测中，对水质、空气等污染物进行快速、准确的检测。
通过设计合理的有机小分子荧光探针，可以实现对特定污染物的高选择性和灵敏度检测。
3. 安全防范有机小分子荧光探针还可用于安全防范领域，如炸药检测、毒物检测等。
通过设计灵敏度高、快速响应的有机小分子荧光探针，可以实现对危险物质的及时检测和预警。
四、结论有机小分子荧光探针的设计与应用在各个领域具有重要的价值和意义。
通过设计合理的荧光基团和优化分子结构，可以实现对目标物的高灵敏度、高选择性的检测。
未来，有机小分子荧光探针在生物医学、环境监测和安全防范等领域仍然有很大的发展潜力。
参考文献：[1] Smith A. Organic small molecule fluorescence probes: the past and the future[J]. Annual Review of Analytical Chemistry, 2015, 8: 81-96.[2] Kim H M, Cho B R. Small-molecule fluorescent probes for live-cell imaging[J]. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(32): 9929-9936.[3] Zhang X, Yapici N B, Gjyrezi A, et al. Design rules for organic small molecule fluorescence in the near-infrared spectral range[J]. Chemical Society Reviews, 2017, 46(11): 2900-2942.。
分子荧光光谱法 ppt课件
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
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溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
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2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
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（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
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6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
分子荧光的机理和荧光探针原理
1.3荧光分子探针识别机理1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET)典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。
其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。
PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。
PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。
由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。
图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。
de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。
化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。
钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。
de Silva研究小组利用类似于EDTA结构的氨羧酸基团设计的化合物3是螯合型PET荧光分子探针，识别基羧酸基团形成一个小的空穴，可以有效螯合碱土金属Ca2+和Mg2+。
大多数PET荧光分子探针的设计是基于受体与客体结合，使光诱导电子转移作用受到抑制，荧光团发射出强烈荧光的原理，但是当与过渡金属作用时，结果有时会发生变化。
荧光探针
荧光探针(fluorescent probe)在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。
但以传统的有机荧光染料为主的荧光探针在应用中也存在一些难以克服的缺陷。
最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，在一定程度上克服了传统有机荧光试剂的缺陷，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点，在此我想作一简单介绍，希望能起到抛砖引玉的作用，如果大家觉得我有什么地方说错的话，欢迎批评指正！让我也从中受益！1、荧光纳米粒子的分类荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。
与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。
另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。
目前荧光纳米粒子主要有无机发光量子点、荧光高分子纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子三大类。
1.1.量子点量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体，是由数百到数千个原子组成的无机纳米粒子，是一种由II-VI 族或者III-V 族元素组成的纳米颗粒。
目前研究较多的主要是CdX(X = S、Se、Te)。
量子点粒径很小，它们的电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。
量子点的体积大小严格控制着它的光谱特征。
量子点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰也相应蓝移。
生物小分子巯基化合物荧光探针研究进展
生物小分子巯基化合物荧光探针研究进展祝新月;王建西;张海霞【摘要】细胞内的小分子巯基化合物在诸多生理过程中扮演重要角色.分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、生物相容性好、实时原位监测等优点.因此,构建可以选择性检测巯基化合物的荧光探针具有重要的生物学和医学意义.根据荧光探针与巯基化合物的反应类型总结了近几年来小分子巯基化合物荧光探针的设计策略和研究进展.【期刊名称】《分析测试技术与仪器》【年(卷),期】2017(023)003【总页数】16页(P143-158)【关键词】分子荧光探针;巯基化合物;设计策略;研究进展【作者】祝新月;王建西;张海霞【作者单位】兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000;兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000;兰州大学化学化工学院,甘肃兰州 730000【正文语种】中文【中图分类】O657.3Abstract: Intramolecular small molecular thiols play key roles in biological processes. Fluorescent probes have the advantages of high sensitivity, good selectivity and biocompatibility, real-time monitoring in situ, etc. As a consequence, it is of great biological and medical significance to designand synthesize probes for selective detection of thiols. The review summarizes the various design strategies of fluorescent probes for the selective detection of biothiols in recent years according to the reaction types between probes and thiols.Key words: fluorescent probes; biothiols; design strategies; research progresses荧光分析法的最大优点是灵敏度高，其检出限通常比紫外分光光度法低2～4个数量级. 由于荧光分析法的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质，使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究等各个领域具有重要意义. 由荧光团和识别基团构建而成的荧光探针除了具有高灵敏度外，还具有高选择性、实时性、原位检测等特点，目前已被广泛应用于工农业、考古学、环境监测等方面. 随着生物技术的不断发展，传统的标记方法在蛋白质、核酸、细胞活体检测等方面已经不能完全满足需求，荧光探针在生物应用方面显示出了巨大的潜力. 研究开发高灵敏度、高选择性、生物相容性好的新型荧光探针成为化学领域的一个研究热点.细胞内的小分子巯基化合物主要包括谷胱甘肽、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、高半胱氨酸和辅酶A等小分子. 其中谷胱甘肽是细胞内含量最高的巯基化合物. 巯基化合物在生物体新陈代谢过程中扮演着重要角色，它们通过在还原态和氧化态之间的平衡而维持着生命体系的氧化还原动态平衡[1]. 体内巯基化合物的含量异常与许多疾病密切相关，如癌症、心血管病、老年痴呆症、艾滋病等[2-6]. 因此设计合成能够选择性检测巯基化合物的荧光探针具有十分重要的生物学和医学意义.本文的综述重点集中于半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),其结构如图1所示. 下面对用于识别这三种巯基化合物的荧光探针设计原理进行归纳.1.1 断裂磺酸酯2005年，Maeda等[7]利用亲核芳香取代反应合成的荧光turn-on探针1用于检测巯基化合物(如图2所示)，这是较早的断裂磺酸酯识别巯基化合物的报道. 探针1在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(10 mmol/L, pH 7.4)/乙醇 (体积比为200∶1)溶剂体系中与GSH在10 min内反应达到平衡，进而被用于测定胆碱酯酶的抑制活性.此后其他小组又陆续报道了断裂磺酸酯的巯基探针2-4(如图3所示)[8-10]. 探针2可在含有1 mmol/L溴化十六烷基三甲铵的磷酸缓冲液(pH = 7.4)中对巯基化合物进行检测，其中对GSH的识别最迅速，在100 min可以达到平衡，对其他含有巯基的化合物则需要250 min. 探针3在二甲基亚砜(DMSO)/磷酸缓冲液(PBS, 10 mmol/L, pH = 7.4),其体积比为50∶50的反应体系中与GSH作用5 mim,即可达到反应平衡. 探针4则可以在1 h内在仅含有1% 乙醇的磷酸缓冲液中实现对巯基化合物的检测.我们课题组合成了断裂磺酸酯的近红外硫醇探针5[11]和6[12]. 探针5在HEPES /DMSO(体积比为19∶1，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)的体系中与硫醇作用后断开O-S键，继而发生分子内1，6-消除，释放出荧光团，实现荧光的off-on过程，10 min达到平衡. 该探针被成功地应用于活细胞，活体和不同组织中巯基化合物的成像(如图4所示).探针6在DMSO/PBS(10 mmol/L)，其体积比为9∶1的反应体系下与巯基化合物反应，在pH 5.5时对Cys、Hcy和GSH均有响应，对Cys的响应优于Hcy和GSH. 而当pH 3.5时，探针6可以选择性识别Cys，探针的细胞毒性很低，被成功地应用于活细胞内巯基化合物的成像.Malwal等[13]也应用该机理设计了硫醇探针7，并将其应用于人结肠癌细胞(DLD-1)细胞中巯基化合物的成像. 探针7与巯基在PBS中反应断开亚磺酸酯键，继而发生分子内1，6-消除释放出荧光分子，达到荧光turn-on效果(如图5所示).1.2 断裂磺酰胺2007年，Bouffard等[14]合成了一个选择性识别巯基化合物的荧光turn-on探针8(如图6所示)，并将其应用于细胞中的硫醇成像. 在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4)中,硫醇和探针8的反应断开了2，4-二硝基苯磺酰胺，释放出苯胺供体，增强了荧光团的推拉电子效应，导致荧光量子产率的提高和吸收发射光谱的红移(158 nm).应用磺酰胺的断裂的原理，人们之后又开发了用于巯基化合物识别的探针9-11(如图7所示)[15-17].我们课题组也合成了断裂磺酰胺的双光子硫醇探针12[18]. 探针以N-丁基-萘酰亚胺为荧光团，以2，4-二硝基苯磺酰基为识别基团，哌嗪为连接基团. 探针12的双光子吸收截面为110 GM，具有良好的生物相容性和pH稳定性，被成功地应用于活细胞和组织(深度50～250 μm)内巯基化合物的成像(如图8所示).1.3 断裂Se-N键较早的关于Se-N键断裂识别硫醇的荧光探针工作是Tang等[19]2007年报道的. 巯基与探针13发生亲核取代反应，断开Se-N键，使荧光增强(如图9所示).文献报道在磷酸缓冲液(pH 7.4, 20 mmol/L) 中，探针对GSH的检测限为1.4 nmol/L，其灵敏度在当时是很高的. 该探针也与含巯基的蛋白质响应，包括硫氧还蛋白、谷胱甘肽还原酶和金属硫蛋白. 探针对它们的检测限比GSH高2～3倍. 探针13被应用于肝脏细胞(HL-7702)和肝癌细胞(HepG2)中巯基化合物的成像. 该课题组[20]在2009年又发表了一篇断裂Se-N键的硫醇探针14(如图10所示)，其在PBS (pH 7.4, 15 mmol/L)中对GSH的检测限更低：144 pmol/L.2012年，Wang等[21]报道了断裂Se-N键的硫醇近红外荧光探针15和探针16(如图10所示)，并将其应用于活细胞和组织成像.1.4 断裂S-S键早在1961年,Ellman等[22]就报道了用5, 5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(即二硫二硝基苯甲酸，Ellman试剂)来检测乙酰胆碱酯酶活性. 事实上大部分含巯基的化合物都可以断开二硫二硝基苯甲酸中的S-S键，二硫二硝基苯甲酸成为了应用最广泛的检测含巯基物质的试剂. 近年来人们开始利用断裂S-S键设计合成硫醇荧光探针.2008年，Pires等[23]合成了罗丹明110的荧光探针17(如图11所示). 它和硫醇反应后荧光明显增强，被成功地测定海拉(HeLa)细胞中GSH的含量变化. 巯基不仅断开了探针中的S-S键，而且由于巯基的亲核性，使邻近的氨基甲酸酯键断裂，释放出罗丹明110荧光团.此后，双硫键-氨基甲酸酯基团常被用来构建硫醇荧光探针. Lee [24]课题组利用此机理报道了硫醇的双光子荧光探针18(如图12所示). 探针在和硫醇反应后荧光强度增加10倍，在生理pH范围内很稳定，被用于HeLa细胞和鼠海马组织的成像(组织成像深度：90～180 μm).2015年，Wang等[25]合成了断裂S-S键的双模荧光探针19，通过S-S键和硫醚两个独立的相应的反应位点，实现对谷胱甘肽的选择性识别. 探针半胱氨酸/同型半胱氨酸作用时，其二硫键被切断，发生分子内环化，脱除临位的碳酸酯，释放出羟基. 同时，半胱氨酸/同型半胱氨酸对硫醇位点进行亲和取代，发生分子内重排，形成氨基取代的氟硼吡咯，发射黄色荧光. 而由于谷胱甘肽的空间位阻较大，不发生分子内重排，形成亚磺酰取代的氟硼吡咯，发射紫色荧光，从而实现选择性识别谷胱甘肽(如图12所示).Cao等[26]合成了断裂S-S键的比率荧光探针20(如图12所示). 它将卟啉和香豆素两个荧光团结合在一起，和硫醇反应后断开S-S键，改变了两个荧光团之间的FRET效应，实现了对硫醇的比率荧光响应，可以用于活细胞中巯基化合物的比率成像.1.5 断裂Se-Se键有文献报道称硫醇断裂Se-Se键的反应速率比断裂S-S键快得多[27]. 2013年Lou等[28]报道了断裂Se-Se键的硫醇荧光探针21(如图13所示). 它可以快速地检测硫醇和监测活细胞内硫醇和活性氧的氧化还原变化.由于巯基具有亲核性，所以含巯基化合物可以和α，β-不饱和羰基发生亲核加成反应. 常见的迈克尔受体有马来酰亚胺、方酸等[29].马来酰亚胺作用于荧光团后，由于n，π*电子转移效应使探针的荧光量子产率降低，当巯基和双键加成饱和后消除了该效应，使荧光团荧光恢复(如图2所示). Matsumoto等[30]合成了一个氟硼吡咯(BODIPY)的探针22(如图14所示). 荧光团的荧光被马来酰亚胺的光致电子转移(photo induced electron transfer, PET)效应猝灭，和硫醇反应后荧光恢复. 有趣的是，马来酰亚胺对BODIPY有效的PET 取代位点在邻位，间位和对位的取代物荧光很强. 邻、间、对位取代物的荧光量子产率分别为0.002、0.37和0.54. 因此，邻位取代探针和硫醇响应后荧光增强350倍.我们课题组也得到了相似的结论[31]. 该工作通过理论计算研究了位置异构对光致电子转移效率的影响. 试验结果表明取代基顺丁烯二酰亚胺基团与萘酰亚胺荧光团之间的相对位置对探针的荧光性能有非常重要的影响，邻位取代的异构体探针相对于间、对位取代的异构体展示出了更优越的荧光开关性能. 探针23具有优良的光学稳定性，pH稳定性，良好的细胞穿透性，低细胞毒性和对含巯基分析物的特异性，被成功地应用于血浆中巯基含量的定性定量检测，及对细胞中的内源性和外源性巯基进行快速的成像.Sreejith等[32]报道了一个方酸染料的近红外荧光探针24. 一般方酸在长波(620～670 nm)处有强烈的吸收(消光系数≥ 105 cm-1 M-1). 在该近红外探针中，将方酸用吡咯扩展π共轭体系后，吸收和发射进一步红移至近红外区(λabs=730 nm,λem=800 nm). 探针和硫醇响应后光谱从近红外区蓝移到可见光区(λabs=440 nm, λem=592 nm). 该探针被应用于评估人血浆中硫醇的浓度，并确认了抽烟会引起血液中硫醇含量的增高(如图15所示).上述原理构建的探针对Cys、Hcy和GSH都可以响应，但是却不能区分识别这三种巯基化合物. 由于这三种巯基化合物在生物体内的生理功能各有不同，所以区分识别这三种巯基化合物具有重要的生物化学意义. 鉴于这样的重要性，人们开发了一些区分识别这三种巯基化合物的荧光探针设计合成的方法.近年来，人们报道了不少基于醛基的环化反应设计合成的荧光探针来识别巯基化合物. 这种类型的探针基本上都用于Cys和Hcy的检测. 因为Cys和Hcy分别为1，2-或1，3-氨基硫醇，与醛基作用后可以形成五元或六元环. 而其他的硫醇如GSH 则不能发生这类环化反应. 这类探针的作用机理如图16所示.2008年，Lin等[33]报道了一个醛基环化的比率荧光探针选择性响应Cys/Hcy(如图17所示). 探针25自身在519 nm处有一个发射峰，是因为富电子的菲并咪唑(供体)和缺电子的醛基(受体)之间的分子内电荷转移(ICT)效应所致. 它和Cys/Hcy反应后，由于消除了ICT效应，产生很大的发射位移(125 nm). 大部分基于醛基的荧光探针对Cys和Hcy有着相似的响应情况. 然而，在2005年Wang小组[34]用商用的肉桂醛衍生物证明了α，β-不饱和醛可以选择性检测Cys而对Hcy没有响应. 2011年，Yuan等[35]又报道了一个香豆素的α，β-不饱和醛探针26，对Strongin小组的发现做了进一步的阐明.Cys和丙烯酸酯的加成环化反应早在1966就被应用于有机合成. 如图18所示，硫醇先和探针中的烯键发生加成反应生成硫醚. Cys和Hcy可以进一步环化释放出荧光团，而GSH产生的硫醚很稳定，不能进一步环化. Cys的环化过程生成七元环，而Hcy则生成八元环. 八元环的张力比七元环要大的多，需要的活化熵也更高，所以七元环的形成速率比八元环要快得多，从而达到探针对Cys的选择性识别. 从2011年开始，常见荧光团(如荧光素、羟基化的香豆素、萘酰亚胺和花菁类等)的丙烯酸酯类荧光探针不断被报道[29].2015年，我们课题组合成了丙烯酸酯的半花菁类可视化近红外荧光探针27[36] . 该工作测定了探针与Cys、Hcy和GSH的响应动力学，很好地验证了探针对Cys 的选择性响应机理，并将探针应用于检测人血清中的Cys含量和活细胞成像(如图19所示).自然化学连接(NCL)反应广泛应用于多肽和蛋白质合成. 如图20所示，NCL有两个过程：第一个过程是一个带有硫酯末端的多肽和一个带有硫醇末端的多肽发生硫酯化传递过程，得到一个新的硫酯化中间体，这是一个可逆过程. 紧接着中间体发生不可逆的分子内S，N-重排过程，在连接位点得到酰胺化产物.2014年，Yang等[37]报道了一个利用NCL反应的分子内质子转移(excited—state intramolecular proton transfer, ESIPT)和光致电子转移机理的双发射荧光探针28(如图21所示). 该探针可以同时区分检测GSH和Cys/Hcy，传感后的发射峰相互分离(>130 nm). 这种现象是因为探针与GSH和Cys/Hcy作用后得到的硫酯中间体发生S，N-重排的速率不同. 该探针被应用于MDA-MB-231细胞和人血清中Cys和GSH的同时检测以及肝癌细胞成像.芳香取代重排机理的探针和Cys/Hcy发生亲核取代作用后，可以紧接着发生分子内的重排过程通过五元或六元过渡态形成氨基化产物，而和GSH则只能发生亲核取代反应，不能再发生分子内的重排，从而实现对三种巯基化合物中某一或两种的选择性识别，如图22所示. 构建这类探针有两点要求：(1)必须带有亲电位点能和巯基发生反应；(2)探针与巯基反应前后光学性质应有明显区别.2015年，Xu等[38]合成了可视化比率荧光探针29(如图23所示)，探针可以选择性地检测和成像细胞内的GSH. 探针和GSH作用后发射红移，而和Cys/Hcy作用后发射蓝移，从而实现了同时区分识别GSH和Cys/Hcy.超分子化学作用如氢键，静电作用也可以被用来构建荧光探针而且可以在一定程度上提高对某种硫醇的选择性.Zhou等[39]利用迈克尔加成和静电作用结合起来设计的荧光探针30(如图24所示)，该探针对Cys具有高选择性. 由于二乙胺基(供体)和吡啶(受体)之间的ICT过程，探针自身荧光很弱，和Cys反应后在500 nm处的荧光增强148倍. 而与Hcy和GSH反应后荧光强度分别只有13和9倍的增强. 动力学分析得到探针和Cys的反应速率比Hcy快115倍，比GSH快36倍. 由此证明了探针对Cys的高选择性是由于带正电的探针和负电的Cys之间的静电作用.2014年，Ik等[40]报道了超分子氢键作用来选择性识别GSH的荧光探针31(如图25所示). 探针以硝基烯键为巯基的反应位点，以18-冠醚基团为超分子氢键作用位点. 在pH 6.0下，探针与GSH作用后荧光发射明显增强，而与等浓度的Cys和Hcy作用变化不大. Cys/Hcy与探针反应后的加合物中，硫醚和氨基之间的连接基较短，不能和冠醚之间产生氢键作用，所以无法消除PET的荧光猝灭作用.还原叠氮基团的机理通常用来构建识别H2S的荧光探针[41]. 而Peng等[42]利用还原叠氮的机理构建了一个丹磺酰叠氮的探针32(如图26所示)，实现了对Hcy的选择性检测. 巯基进攻探针的叠氮基团形成中间体，中间体经过质子转移中和N 上的负电荷，通过分子内环化过程失去一分子N2得到磺胺荧光产物. Hcy的环化产生五元环产物，可以再和一分子硫醇反应生成二硫化物. 而Cys的环化只能产生四元环产物，四元环的张力较大，不稳定所以产生四元环产物的过程很不容易发生. 从而实现了探针对Hcy的选择性识别.2015年，Liu等[43]报道了双迈克尔加成/逆羟醛缩合串联反应的探针33(如图27所示)，实现了对Cys的选择性识别，并被应用于检测人血清中的Cys含量和活细胞中的Cys成像. 由于氟硼吡咯部分的吸电子作用，探针中的炔基具有很好的亲电反应活性. 探针与Cys的巯基和氨基发生两次的迈克尔加成得到一个具有五元环的中间体，接着发生逆羟醛缩合反应得到强荧光的氟硼吡咯. Hcy、GSH如果发生双迈克尔加成则分别生成具有六元环和十元环的中间体，然而这样的过程从动力学上看是很难进行的. 作者通过试验证明了探针与Hcy和GSH的反应产物为一次迈克尔加成的加合物，并不能发生类似于Cys那样的串联反应过程，从而实现了探针对Cys的选择性识别.点击化学反应也被应用于巯基化合物探针的设计合成，但报道的文献较少. Yin课题组[44-45]分别在2013年和2016年设计了两个巯基-色烯点击化学的荧光探针34和35，探针与硫醇的作用产物可以和Cu2+、Cd2+、Hg2+作用再生为34.该探针被应用于人血浆中巯基化合物的检测和HepG2细胞成像. 探针35和Cys的荧光响应较Hcy和GSH强得多，可以选择性地检测Cys并被应用于HepG2细胞成像(如图28所示).从上述研究进展来看，近十年来关于小分子巯基化合物的荧光探针已经报道了很多. 它们大多是基于巯基的亲核性设计而成. 将一些化学反应联合使用以及将化学反应和超分子作用结合也提高了探针的选择性. 然而，能够在复杂生物环境中选择性检测小分子巯基化合物的探针的设计合成工作仍然存在很多挑战. 比如，探针在含巯基化合物的实际生物样品检测中可能受很多物质(如含巯基的蛋白、内生的H2S)的干扰. 未来小分子巯基化合物荧光探针的研究方向可以集中在以下4个方面：(1)由于近红外光的生物应用优势，要设计更多近红外荧光探针；(2)将具有高基质选择性和特异性的酶应用于高选择性探针的设计合成工作中；(3)设计更多具有细胞器、组织、器官特异性靶向的探针；(4)设计可以原位指示组织器官病变(如肿瘤)过程的探针以达到治疗诊断目的.【相关文献】[1] Finkelstein J D, Martin J J. Homocysteine [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000, 32:385-389.[2] Jones D P, Carlson J L, Mody Jr V C, et al. Redox state of glutathione in human plasma[J]. Free Radical Biol Med, 2000, 28: 625-635.[3] Kemp M, Go Y M, Jones D P. Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems: A perspective on redox systems biology[J]. Free Radical Biol Med, 2008, 44: 921-937.[4] Finkel T, Holbrook N J. 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《有机分子荧光》课件
2023
PART 04
有机荧光分子的性能研究
REPORTING
荧光光谱学研究
荧光光谱学是研究有机荧光分子发光特性的重要手段。通 过荧光光谱，可以了解荧光分子的激发态能级结构、发射 波长、Stokes位移等信息，有助于深入理解荧光发光的机 理。
荧光光谱学研究还包括对荧光光谱的定性分析和定量分析 ，通过对比不同荧光分子的光谱，可以发现它们之间的差 异，为荧光分子的应用提供依据。
03
染料。
荧光素的合成
荧光素是一类具有荧光性质的染料， 可以通过苯酚和芳胺的缩合反应合成 。
在缩合反应中，苯酚和芳胺通过亚甲 基桥连接，形成具有共轭结构的荧光 素分子，该分子在可见光下呈现荧光 性质。
香豆素类荧光染料的合成
香豆素类荧光染料是一类具有香豆素结构的荧光染料，可以 通过香豆素的羟基化、烷基化、酯化等反应合成。
通过研究激发态动力学，可以深入了解荧光发光的过程和机理，为荧光 分子的优化和应用提供理论支持。
激发态动力学研究方法包括时间分辨光谱技术、瞬态吸收光谱技术等， 这些方法可以用来测量荧光分子的激发态寿命、能量转移和传递等动力 学过程。
2023
PART 05
有机荧光分子的应用实例
REPORTING
有机荧光染料在生物医学中的应用
生物成像
用于标记生物分子和细胞，实现荧光成像和示踪 研究。
化学传感
用于检测气体、液体和固体的化学物质，实现快 速、灵敏的检测。
光学材料
用于制造荧光灯、显示器、激光器等光学器件， 提高产品的性能和稳定性。
2023
PART 02
有机荧光分子的分类
REPORTING
偶氮荧光染料
偶氮染料是一类具有偶氮基团（ -N=N-）的染料，通常呈现黄
席夫碱型有机小分子荧光探针的制备与表征——推荐一个综合化学实验
No. 2
doi: 10.3866/PKU.DXHX201906008
71
可以促进学生对化学知识体系的融会贯通，更能激发学生学习化学的积极性。这些知识的掌握和实 践，也为本科毕业生在相关领域的深造和就业打下良好的基础。
本实验包括席夫碱有机配体的设计合成，红外光谱、核磁共振波谱和质谱等常用表征手段的应 用，以及荧光性质的研究等内容。
Department of Chemistry, School of Chemistry and Biological Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, P. R. China.
Abstract: In this paper, a new experiment named “synthesis and characterization of a fluorescent molecule based on Schiff-base” is introduced. It contains the synthesis and characterization of organic compounds, the determination of fluorescence, and the detection of metal ions. This experiment is helpful for students to better understand inorganic chemistry, organic chemistry and analytical chemistry. Moreover, it gives students an opportunity to know the study of organic fluorescent probes. This will stimulate students’ interest in scientific research and cultivate their research ability. Thus, this experiment can be introduced to senior undergraduates.
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有机小分子荧光探针的研究
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛，下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克