正常小鼠原代骨骼肌细胞培养
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0.25%胰酶， 37度水浴消化 20min ，每 5min 摇动或吹打 1次 ↓
生长培养基终止消化，反复吹打，依次 100， 200， 400目过筛 ↓
离心， 1000rmp,10min ，弃去上清 ↓
重悬，计数细胞，接种密度以 5 ×105个 /ml
↓ 悬液加入未经 PPL 包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞， 37度， 1h
性地沿一个方向排列。当细胞融合 80%以上后，开始形成肌管。
2、免疫细胞化学染色 1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白 （desmin ），可采用鼠抗人及小鼠 desmin 一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。
3、免疫细胞化学染色 2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（ myosin）单克隆抗体检测。取含骨 骼肌细胞盖玻片常规处理后进行 myosin 的细胞免疫化学染色， PBS 代替一抗做阴性对照。 结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。
PPL 包被的培养瓶中，差速贴壁去
除成纤维细胞， 37度培养 1h 后，转移包被瓶中，生长培养基培养， 4d 换液，以后每天换液 1
次。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。
12h 后，细胞开始贴壁，
Fra Baidu bibliotek
72h 后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律
PriCells –正常小鼠原代骨骼肌细胞培养 一、实验试剂 1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement 2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO 3、洗涤液： 1 ×PBS （ pH 7.4 ） + 1% P/S 4、染色液： 0.4% Trypan Blue 5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit 6、检测试剂：鼠抗人及大鼠 desmin 一抗，肌球蛋白（ myosin）单克隆抗体
↓ 转移包被瓶中，生长培养基培养，培养 37℃， 5%CO 2
↓ 4d 换液，以后每天换
四、实验操作
1、 新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿， 次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约 0.1cm3 小块；
Hank’ｓ洗 3
2、 将剪碎的肌肉移至离心管， Hank’ｓ洗 3次，静置 1min，弃去上层液及漂浮组织
二、实验器械 1、培养皿 2、培养瓶 3、直剪和眼科剪 4、眼科镊和止血钳 5、烧杯 6、 15ml 离心管
三、实验流程 取肌肉于平皿， Hank’ｓ洗 3次 ↓ 剔除脂肪、结缔组织 ↓ 肌肉标本剪约 0.1cm3小块 ↓ 移至离心管， Hank’ｓ洗 3次 ↓
静置 1min，弃去上层液及漂浮组织 ↓
3、 向上述离心管中加入 0.25%胰酶， 37度水浴消化 20min ，每 5min 摇动或吹打 1次离心管， 然后加入生长培养基终止消化；
4、 反复吹打后，依次 100，200， 400目过筛，滤液收集后， 1000r/min 离心 10min ；
5、 弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经
六、注意事项
1、胰酶消化过程中，也可采用 15min 两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定， 一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。
2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。 3、骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。 4、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。
生长培养基终止消化，反复吹打，依次 100， 200， 400目过筛 ↓
离心， 1000rmp,10min ，弃去上清 ↓
重悬，计数细胞，接种密度以 5 ×105个 /ml
↓ 悬液加入未经 PPL 包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞， 37度， 1h
性地沿一个方向排列。当细胞融合 80%以上后，开始形成肌管。
2、免疫细胞化学染色 1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白 （desmin ），可采用鼠抗人及小鼠 desmin 一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。
3、免疫细胞化学染色 2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（ myosin）单克隆抗体检测。取含骨 骼肌细胞盖玻片常规处理后进行 myosin 的细胞免疫化学染色， PBS 代替一抗做阴性对照。 结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。
PPL 包被的培养瓶中，差速贴壁去
除成纤维细胞， 37度培养 1h 后，转移包被瓶中，生长培养基培养， 4d 换液，以后每天换液 1
次。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。
12h 后，细胞开始贴壁，
Fra Baidu bibliotek
72h 后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律
PriCells –正常小鼠原代骨骼肌细胞培养 一、实验试剂 1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement 2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO 3、洗涤液： 1 ×PBS （ pH 7.4 ） + 1% P/S 4、染色液： 0.4% Trypan Blue 5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit 6、检测试剂：鼠抗人及大鼠 desmin 一抗，肌球蛋白（ myosin）单克隆抗体
↓ 转移包被瓶中，生长培养基培养，培养 37℃， 5%CO 2
↓ 4d 换液，以后每天换
四、实验操作
1、 新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿， 次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约 0.1cm3 小块；
Hank’ｓ洗 3
2、 将剪碎的肌肉移至离心管， Hank’ｓ洗 3次，静置 1min，弃去上层液及漂浮组织
二、实验器械 1、培养皿 2、培养瓶 3、直剪和眼科剪 4、眼科镊和止血钳 5、烧杯 6、 15ml 离心管
三、实验流程 取肌肉于平皿， Hank’ｓ洗 3次 ↓ 剔除脂肪、结缔组织 ↓ 肌肉标本剪约 0.1cm3小块 ↓ 移至离心管， Hank’ｓ洗 3次 ↓
静置 1min，弃去上层液及漂浮组织 ↓
3、 向上述离心管中加入 0.25%胰酶， 37度水浴消化 20min ，每 5min 摇动或吹打 1次离心管， 然后加入生长培养基终止消化；
4、 反复吹打后，依次 100，200， 400目过筛，滤液收集后， 1000r/min 离心 10min ；
5、 弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经
六、注意事项
1、胰酶消化过程中，也可采用 15min 两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定， 一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。
2、传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。 3、骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。 4、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。