(三)原生质体融合

二、原生质体融合育种程序
（一）直接亲本及遗传标记的选择 （二）原生质体的制备与再生 （三）原生质体融合 （四）融合体再生
（一）直接亲本及遗传标记的选择
一般把诱变谱系中筛选获得的不同正变 株作为直接亲本进行融合。 现在认为融合亲本应采用较大差异的近 亲菌株。

标记：营养缺陷型，抗性 热致死（灭活）孢子颜色菌落形态 遗传分析：采用营养缺陷型，抗性 提高产量：热灭活 荧光染色标记
酶解
过滤
离心 原生质体
培养基组成 Musilkova 等研究发现，黑曲霉在限制性培养 基或合成培养基中分离原生质体的数量会显著 增加。 放线菌只有在加入甘氨酸的培养基中培养后， 才能使酶类易于渗入和瓦解细胞壁。 ②菌体的培养方式 丝状菌常用平板玻璃纸法 细菌和酵母多用振荡沉没培养法。
①
（1）影响原生质体制备的因素
沉淀物用酶液悬浮水解去壁制成原生质体 高渗溶液洗涤原生质体 原生质体稀释后取适量放入无菌培养皿 培养皿移至紫外灯下诱变 再生培养基再生培养 分离优质菌株并遗传稳定性鉴定 菌种特性和发酵性能研究
出发菌株的培养和 原生质体制备
选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度 加入原生质体悬浮液（含高渗溶液）
诱变处理 离心弃诱变剂、原生质体用稳定液洗涤
原生质体育种
Weibull 等于 1953 年首次用溶菌酶处理巨大芽 孢杆菌细胞获得原生质体，并首次提出原生质 体的概念。 Mcquillen 于 1955 年首次发现巨大芽孢杆菌原 生质体再生方法。 1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会 上提出原生质体融合。

与正常细胞相比，原生质体具有一些 新的独特的特性
再生培养基再生培养 分离优质菌株并遗传稳定性鉴定
菌种特性和发酵性能研究
1、转化 染色体DNA或其他线状染色体转化原生质 体效率低，质粒DNA具有高频转化率。
三、原生质体转化育种
2、影响原生质体转化的因素 ①融合促进剂PEG来源、批号及聚合度。 ②制备原生质体的菌丝年龄、菌丝生长条件、 原生质体再生条件。 ③转化时，质粒及原生质体的浓度。 ④再生培养基的组成。
（3）
常规诱变育种选用材料为孢子， 这些休眠体对诱变剂比较迟钝， 获得的大部分为负变株，
而制备原生质体的出发材料一般为对数期的 细胞，活力较强，对环境和诱变剂较为敏感， 破壁和再生过程中又淘汰了大量弱势菌株， 能再生的菌株不论初级代谢与次级代谢过程 均较活跃，故高产优质菌株比例比较大
（4）原生质体再生材料无需经过遗传标记， 减少了对菌株的损伤和优良性状的菌株。
一、原生质体再生育种
1、定义：制备原生质体—直接再生—筛选高产 变异株
完整细胞
原生质体
完整细胞
2、产生比常规诱变还高的正变率，其原因有 以下方面：
（1）原生质体比较敏感，制备和再生过程中 的各种化合物及环境中的物理因子对染色体 或质粒DNA都有一定诱变效应。
（2）原生质体再生本质上是细胞壁重建和分 裂能力的恢复的过程，再生的细胞壁在组成 和结构上发生变化，甚至于产生有利于细胞 代谢产物分泌的变异。
二、原生质体诱变育种
1、定义： 以微生物原生质体为原料，物理化学诱变 剂处理，再生培养基再生，从中筛选高产菌 株。
2、原生质体作为诱变材料的优点 ①单孢子壁结构致密牢固，不利于诱变剂向 核内渗透。 ②孢子代谢缓慢，造成基因突变频率较低或 因表型延迟而漏筛。
3、原生质体诱变一般程序
10ml对数期微生物培 养为离心收集菌体

（二）原生质体的制备与再生
1、制备: 原生质体分离：机械法、非酶法和酶法 （1）平板玻璃纸或摇瓶振荡培养 （2）取年轻菌体于高渗溶液中，加有关酶液， pH、温度下酶解 （3）过滤除去菌丝片段 （4）低速离心弃上清,高渗溶液重悬
诱 变
沉淀用高渗亲本
振荡培养
4、原生质体转化一般程序
对数期微生物培养为 离心收集菌体
沉淀物用酶液悬浮水解去壁制成原生质体 高渗溶液洗涤原生质体、2倍SMM浓缩 液、质粒DNA、40%PEG 混合2min，离心 再生培养基再生培养 分离优质菌株并遗传稳定性鉴定 菌种特性和发酵性能研究
四、原生质体融合育种
原生质体融合（protoplast fusion）20世纪 70年代发展起来的基因重组技术。 Fodorhe Schaeffer于1976年分别报道了巨 大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融 合，微生物融合现象得到证实，并建立了相 应的试验体系。
2、扩大重组的亲本范围
3、原生质体融合时亲本整套染色体参与 交换，遗传物质转移和重组性状较多，集 中双亲优良性状计划更大。
不足之处是原生质体融合后DNA交换和重 组是随机的发生，增加重组体分离筛选的难 度。 此外细胞对异体遗传物质的降解和排斥作 用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响 原生质体融合的重组频率，使远缘融合存在 较大困难。
3、实例： 弗氏链霉菌再生后，泰乐菌素产量提高3倍 产二素链霉菌再生后，螺旋霉素产量提高2倍 原因可能为13%-85%的质粒脱落， 解除抗生 素 的调节机制。
4、原生质体再生育种一般程序
出发菌株的选择 菌株的活化和预培养 原生质体的制备 原生质体再生 高产菌株分离 复筛 遗传稳定性鉴定 菌种特性和发酵性能研究
1、由于去除了细胞壁，对外界环境影响更加敏 感，对诱变剂的诱变效应也更为强烈。
2、破壁后细胞表面的受体和噬菌体的结合部位 相应不存在，失去对噬菌体的敏感性。 3、由于解除了遗传物质的最大屏障—细胞壁， 也不受感受态的影响，可进行原生质体转化和 融合等基因重组。
以微生物原生质体育种的常见的 育种方法有： 一、原生质体再生育种 二、原生质体诱变育种 三、原生质体转化育种 四、原生质体融合育种

原生质体融合：
指亲本的原生质体在高渗条件下使之 混合，由聚乙二醇（ PEG ）作为助融剂， 使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两 亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传 重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获 得具有理想性状的重组子。
一、与常规杂交相比，原生质体
融合育种的优越性和不足
1、大幅度提高亲本之间的重组频率