第三章 蛋白质

(8)确定肽段在多肽链中的次序。
蛋 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼
白 质
此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的
一 氨基酸顺序。
级
结
构
的
测
定
• 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键 的多肽链，
• 再利用双向电泳技术分离出各个肽段， 用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成 及顺序分析，
• 然后同其它方法分析的肽段进行比较， 确定二硫键的位置。
• 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之 间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯 基还原法拆分多肽链间的二硫键。
• (4)测定 每条多肽 链的氨基 酸组成， 并计算出 氨基酸成 分的分子 比；
(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。
• 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨 基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。
第三章 蛋白质
第一节蛋白质的结构
• 蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide) 链以特殊方式结合而成的生物大分子。
• 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是 将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为 蛋白质。
• 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约 6000到1000000道尔顿甚至更大。
四肽的结构
端 余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩
基 合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。
氨
RO
R n-1O
Rn O
基
H2N CH C
HN CH C HN CH C OH
酸
N-端 氨 基 酸
C- 端 氨 基 酸
测
定
H+
RO
Rn O
NH2NH2H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
氨基酸酰肼
O NH CH C
R1
O NH CH C
R2
O NH CH C
R3
O NH CH C
R4
水解位点
肽链
胃 蛋 白
•
Pepsin：R1和R2 ＝R1=苯丙氨酸
酶 Phe,色氨酸Trp,
酪氨酸Tyr; 亮氨
酸Leu以及其它疏
水性氨基酸水解
速度较快。
• (7)测定每个肽段的氨基酸顺序。
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
C-端 氨 基 酸
氨肽酶法
末 端
• 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的 N-端逐个的向里水解。
基 • 根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的
氨 氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残
基 基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的
酸 N-末端残基顺序。
测 • 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮
定 氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
白 质
先进行拆分。
一
级
结
构
的
测
定
• (2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
• 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白 质分子量之间的关系，即可确定多肽链的 数目。
• (3) 二硫键的断裂
• 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可 在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存 在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二 硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保 护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
1,测定蛋白质的一级结构的要求
• 1，样品必需纯（>97%以上）； • 2，知道蛋白质的分子量； • 3，知道蛋白质由几个亚基组成； • 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据
分子量计算每种氨基酸的个数。 • 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的
含量。
2，测定步骤
• (1)，多肽链的拆分。
蛋 • 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须
羧肽酶法
末 端 基 氨
• 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的 C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出 酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而 知道蛋白质的C-末端残基顺序。
基 • 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B
酸 来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
测 • 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C定 末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末
RO
RO
酸
O2N
F + H2N CH C
O2N
HN CH C
测 定
NO2 DNFB
H+ H2O
O2N
N-端 氨 基 酸 RO
HN CH C OH
NO2 DNP衍 生 物
+
氨基酸
NO2 DNP-氨 基 酸
肼解法
末
• 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水 条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其
R3
O NH CH C
R4
水解位点
肽链
• Trypsin ：R1=赖氨 酸Lys和精氨酸Arg 侧链（专一性较强， 水解速度快）。
胰 蛋 白 酶
O
O
O
O
糜 NH CH C NH CH C NH CH C NH CH C
蛋 白
R1
R2
R3
R4
酶
水解位点
肽链
• 或胰凝乳蛋白酶 （Chymotrypsin ）：R1=苯丙氨 酸Phe,色氨酸Trp, 酪氨酸Tyr; 亮氨 酸Leu，蛋氨酸 Met和组氨酸His 水解稍慢。
一、蛋白质的一级结构
•蛋白质的一级结构(Primary structure)包 括组成蛋白质的多肽链数目.
• 多肽链的氨基酸顺序， • 多肽链内或链间二硫键的数目和位பைடு நூலகம்。
• 其中最重要的是多 肽链的氨基酸顺序， 它是蛋白质生物功能 的基础。
蛋白质一级结构的测定
• 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础。自从1953年F.Sanger测 定了胰岛素的一级结构以来，现在已经 有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
• 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是 N-端氨基酸分析法。
二硝基氟苯（DNFB）法
• Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，
能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝
末 基苯衍生物（DNP）。
端 基 氨 基
• 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。 该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨 基酸可以用色谱法进行鉴定。
端残基的肽键。
• (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两 种或多种不同的断裂方法将多肽样品断 裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其 分离开来。
• 酶解法:
• 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热
多 肽
菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶
链
的
选
择
性
降
解
O NH CH C
R1
O NH CH C
R2
O NH CH C
二、蛋白质的三维结构
1、蛋白质的二级结构
• 蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽 链的主链在空间的排列,或规则的几何 走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链 的构象及链内或链间形成的氢键。