X射线晶体衍射技术
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过饱和溶液
蛋白质结晶要点
蛋白质的分子量很高，几何形状较复杂，表面带多种电荷； 分子间相互作用或相互结合的点很多，而可能形成有序排列的 关键结合点和几何匹配位置又很少； 在外界条件(如PH、温度、不同溶剂等)的影响下，分子构象 容易产生某些变化； 在蛋白质结晶时．必须保持在水合状态，或者在生理pH和温 度条件下。 要使生物大分子结晶和生长出大的晶体．最关键的是控制过饱 和度的量和速度．过饱和度要低，而速度要尽可能地慢。
X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用
X-射线结构分析基本原理
X-射线是波长很短的电磁波，约0.1--100Å。
结构分析用的是单色X-射线，其波长在1Å数量级，相 当于分子中原子之间的距离。
用于结构分析用的仪器是X-射线仪。由X-射线管、滤波 器、高压系统（30-50KV)、真空系统(10-4-10-5 mmHg柱） 和照相机组成。
欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完好结晶 的关键之一。重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。一 个蛋白质样品要想使其能结晶，至少需要97%的均一性。
生物大分子的晶体培养要求
要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分析 的晶体。这里所谓“适合于”包括两层意思：
晶体内部结构要具有有序性．是单晶，不是孪晶，否则无 法得到具有结构本身特点的衍射花样； 晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度大体 上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。 一般讲 分子量为50000左右的蛋白质分子，需要0.3 mm3或者更 大的晶体，才有可能作高分辨率的结构分析。对于分子量 更大的蛋白质分子，那就需要更大的晶体。为了满足上述 要求，首先要使生物大分子结晶，然后设法长大。
发展历史
1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了 测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的 距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽 链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三 维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解 决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数 学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型 药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。
所形成的晶体在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常 常由溶剂分子所占有，绝大部分在晶体中是无序的。
晶体的蛋白质分子之间仅少量的区域发生接触，这些区域的相 互作用是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子层 发生作用。这是为什么由X射线晶体学测定的蛋白质结构与在 溶液中测定的蛋白质结构几乎相同的主要原因。
X射线晶体衍射技术
在蛋白质晶体结构测定中的应用
X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方 法。揭示分子结构与功能的科学。
目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内 部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看 到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、 形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法 （X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶 体的空间结构。
衍射线
X射线源 入射线 晶体
Hale Waihona Puke 晶体结构的基本知识日常所见晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶 体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成 晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相 同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射 图上斑点的位置与黑度。
平行光束
θ
原子层 d d
不同物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下 来的衍射图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分 布和分子的空间结构。
晶体的衍射
X射线晶体结构分析是利用晶体的X射线衍射现象来测定
晶体及分子的结构。 X射线衍射可简单理解为当一束平行的X射线投射到晶体上 时，大部分入射线穿过晶体沿原方向前进，而部分射线却偏 离了入射方向。
工作原理：由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过 滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色X-射线。单色 X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得 到衍射图，然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定 与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。。
用X-射线衍射法测定晶体结构是根据晶体中原子重复出现的 周期性结构。 当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d与 入射角的X-射线波长λ、入射角θ之间的关系能满足布拉格方 程式。则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射 图谱。
衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。
三、蛋白质X射线晶体结构测定程序
样品处理：培养大的、质量好的晶体； 蛋白质结晶和晶体生长 晶体衍射数据的测量和处理； 位相确定； 分子模型的建立和修正
获得好的晶体是 结构分析中最关键的一步
由于球状蛋白分子量大，且表面基团的构象较不稳定，欲获得 排列有序的晶体比较难。
蛋白质结晶过程是一个有序化过程
蛋白质晶体培养一般规律
蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程， 即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固 体。 一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶 核，并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶 液能开始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定 的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等) 而结合到晶核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个 体系能量降低而形成晶体。
蛋白质结晶要点
蛋白质的分子量很高，几何形状较复杂，表面带多种电荷； 分子间相互作用或相互结合的点很多，而可能形成有序排列的 关键结合点和几何匹配位置又很少； 在外界条件(如PH、温度、不同溶剂等)的影响下，分子构象 容易产生某些变化； 在蛋白质结晶时．必须保持在水合状态，或者在生理pH和温 度条件下。 要使生物大分子结晶和生长出大的晶体．最关键的是控制过饱 和度的量和速度．过饱和度要低，而速度要尽可能地慢。
X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用
X-射线结构分析基本原理
X-射线是波长很短的电磁波，约0.1--100Å。
结构分析用的是单色X-射线，其波长在1Å数量级，相 当于分子中原子之间的距离。
用于结构分析用的仪器是X-射线仪。由X-射线管、滤波 器、高压系统（30-50KV)、真空系统(10-4-10-5 mmHg柱） 和照相机组成。
欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完好结晶 的关键之一。重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。一 个蛋白质样品要想使其能结晶，至少需要97%的均一性。
生物大分子的晶体培养要求
要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分析 的晶体。这里所谓“适合于”包括两层意思：
晶体内部结构要具有有序性．是单晶，不是孪晶，否则无 法得到具有结构本身特点的衍射花样； 晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度大体 上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。 一般讲 分子量为50000左右的蛋白质分子，需要0.3 mm3或者更 大的晶体，才有可能作高分辨率的结构分析。对于分子量 更大的蛋白质分子，那就需要更大的晶体。为了满足上述 要求，首先要使生物大分子结晶，然后设法长大。
发展历史
1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了 测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的 距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽 链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三 维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解 决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数 学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型 药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。
所形成的晶体在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常 常由溶剂分子所占有，绝大部分在晶体中是无序的。
晶体的蛋白质分子之间仅少量的区域发生接触，这些区域的相 互作用是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子层 发生作用。这是为什么由X射线晶体学测定的蛋白质结构与在 溶液中测定的蛋白质结构几乎相同的主要原因。
X射线晶体衍射技术
在蛋白质晶体结构测定中的应用
X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方 法。揭示分子结构与功能的科学。
目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内 部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看 到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、 形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法 （X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶 体的空间结构。
衍射线
X射线源 入射线 晶体
Hale Waihona Puke 晶体结构的基本知识日常所见晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶 体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成 晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相 同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射 图上斑点的位置与黑度。
平行光束
θ
原子层 d d
不同物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下 来的衍射图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分 布和分子的空间结构。
晶体的衍射
X射线晶体结构分析是利用晶体的X射线衍射现象来测定
晶体及分子的结构。 X射线衍射可简单理解为当一束平行的X射线投射到晶体上 时，大部分入射线穿过晶体沿原方向前进，而部分射线却偏 离了入射方向。
工作原理：由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过 滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色X-射线。单色 X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得 到衍射图，然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定 与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。。
用X-射线衍射法测定晶体结构是根据晶体中原子重复出现的 周期性结构。 当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d与 入射角的X-射线波长λ、入射角θ之间的关系能满足布拉格方 程式。则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射 图谱。
衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。
三、蛋白质X射线晶体结构测定程序
样品处理：培养大的、质量好的晶体； 蛋白质结晶和晶体生长 晶体衍射数据的测量和处理； 位相确定； 分子模型的建立和修正
获得好的晶体是 结构分析中最关键的一步
由于球状蛋白分子量大，且表面基团的构象较不稳定，欲获得 排列有序的晶体比较难。
蛋白质结晶过程是一个有序化过程
蛋白质晶体培养一般规律
蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程， 即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固 体。 一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶 核，并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶 液能开始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定 的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等) 而结合到晶核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个 体系能量降低而形成晶体。