第四章细胞破碎和分离提取技术

1）酶溶法 ） 2）化学法 ） 3）物理法 ）
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎 、
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 ） 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌， 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎， 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物 •可采用间歇式或连续操作珠磨机 可采用间歇式 连续操作珠磨机 间歇式或 •增加装珠量、延长破碎时间、提高 增加装珠量 延长破碎时间 装珠量、 破碎时间、 转速等手段可提高破碎率 转速等手段可提高破碎率 •→总能耗增加且须注意换热 •适用于多数微生物细胞，esp.有大 适用于多数微生物细胞，esp.有大 藻类和真菌菌丝） 量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和 亚细胞器） 质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞
2）高压匀浆法 ）
high（ high-pressure homogenization ）
• 破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的 破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀， 环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后， 环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急 剧释放到低压环境 • 破碎作用力：突然减压和高速冲撞 破碎作用力： • 操作参数少且易于确定，实验 操作参数少且易于确定， 室及工业生产中均可 室及工业生产中均可 • 适用于酵母和多数细胞的破碎 适用于酵母和多数细胞 酵母和多数细胞的破碎 • 对易造成堵塞的团状或丝状真 对易造成堵塞的团状或丝状真 及一些易损伤匀浆阀、 菌及一些易损伤匀浆阀、质地 阀座 坚硬的亚细胞器一般不适用 坚硬的亚细胞器一般不适用
• G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖 典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95% • G-：典型 典型E.Coli，肽聚糖 ，肽聚糖10% 细菌的 成分： • 不同类型细菌的细胞壁结构成分： 不同类型细菌 细胞壁结构成分 细胞壁组成 肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质 G+ 60-95% 有 一般无 0 G10% 0 约20% 较高
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范 以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同 机理不尽相同， 包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（ 围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验 室或工业用） 室或工业用）
方法 使用规模 珠磨 实验室、工业用 实验室、 高压匀浆 实验室、工业用 实验室、 酵母菌、细菌 酵母菌、 超声破碎 实验室 细菌
破碎方法的选择
• 选择的一般原则 • A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 提取产物在细胞质内， • B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 提取产物在细胞膜附近， • C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机 提取产物与细胞膜或细胞壁结合， 械法结合的方法
破碎过程中应注意的问题 A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化 对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除， C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响 在上游发酵阶段， D、菌种的培育及改造，胞内产物 → 胞外产物 菌种的培育及改造，
3、化学法破碎 、
• 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分 • 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁 或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→ 或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→化学 渗透法 •利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基 利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯； 磺酸钠、 X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等 磺酸钠、Triton X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等 •优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清 优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低， •A、价格昂贵，引起新的污染； 价格昂贵，引起新的污染； •B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需 一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差， 与机械法连用。 与机械法连用。
适用对象 酵母、藻类及丝状真菌 酵母、
2、细胞物理破碎方法 、
• 1）渗透压冲击法（osmotic shock） shock） 渗透压冲击法（ • 最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞， 最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞， eg.动物细胞和革兰氏阴性菌 eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 动物细胞和革兰氏阴性菌。 高渗介质中？ • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低 细胞于高渗介质中 脱水达到平衡后， 渗透压的水或缓冲液中， 渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂 • 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） Thawing） 冻结－融化法（ • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化 急剧冻结后在室温缓慢融化， 坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
撞击环 阀
3）超声波破碎（ultrasonication） 超声波破碎（ultrasonication）
• 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用， 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。 缺点： 缺点： A、影响因素多，细胞种类、浓度 影响因素多，细胞种类、 和处理时间、探头材料和形状； 和处理时间、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低； 有效能量的利用率低； C、产热大，需控温； 产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 不易放大， 模的细胞破碎。 模的细胞破碎。
另取一烧杯，分别称取 另取一烧杯，分别称取1 mmol EDTA； 0.15 mol NaCl； ； ； 2mol 尿素；3mmol GSH和0.6mmol GSSG 尿素； 和 溶解并定容至 用buffer A溶解并定容至 溶解并定容至1L
方案1 方案1
• Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）： 缓冲液（ ）：50mL 0.1 mol/L 缓冲液 ， ）： 三羟甲基氨基甲烷（ 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与 ）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸 盐酸 混匀后，用去离子水定容至100mL。 混匀后，用去离子水定容至 。 “x”ml solution of A＋ “y”ml solution of B ＋ Involves extra work（making up two solutions） （ ） 缺点 Waste（The unused volumes of A and B are discarded） （ ） Usually inaccurate Why? The presence of extra salts may change the pH or molarity of the buffer due to common ion effects
How to making a buffer？ ？
• 溶液： 溶液： • 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4 、pH7.5缓冲液 缓冲液 • 含1 mmol/L EDTA • 0.15 mol/L NaCl • 2mol/L尿素 尿素 • 3mmol/L GSH和0.6mmol/L GSSG 和 • 1L
细胞破碎（ 细胞破碎（Cell disruption） ）
• 细胞的结构 • 动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质 动物/植物和微生物：前者没有细胞壁， 和蛋白质构成的柔软的细胞膜， 和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎 • 细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁 细菌： 坚固Why？较难破碎。 坚固Why？较难破碎。 • 酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多 酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、 糖和蛋白质构成， 糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚
5、超临界细胞破碎技术 、
• 超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有 超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体， 类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度， 类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具 有较好的流动性能、 有较好的流动性能、传质性能和溶解性能 • 利用超临界CO2做介质，高压 做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突 易于渗透到细胞内。 利用超临界 然降压后， 然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生 破裂 • 可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母 破碎细胞壁较厚的细胞如酵母 • 甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果
生化分离工程
第四章 细胞破碎和分离提取技术
破碎缓冲液
• 一般为 一般为0.1-0.2mol/L，pH为7－8的磷酸盐缓冲液或 ， 为 － 的磷酸盐缓冲液或 的磷酸盐缓冲液或Tris缓 缓 冲液（与细胞内环境相似） 冲液（与细胞内环境相似） 抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原； 抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外 界氧化环境。 二硫苏糖醇 二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME， 界氧化环境。eg.二硫苏糖醇 ， 巯基乙醇 ， 半胱氨酸Cys、谷胱甘肽 还原型） 半胱氨酸 、谷胱甘肽GSH （还原型） 酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂 酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯 、 基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc 基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶 ， •PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP ：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮 吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀） 吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）
• 酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治” 酵母菌： 甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治” 组成的 结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度 结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度
4.1 细胞破碎技术
• 细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 细胞破碎的目的： 增大通透性）或破碎， （增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物 机械法 固体剪切作用 液体剪切作用 干燥处理 非机械法 溶胞作用 珠磨法、 珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法 高压匀浆、超声破碎、
补充1 补充
4.2 Buffers
• What is buffer？ ？ • Why use buffer？ ？
pH = pKa ± 0.5时，作为 时 作为buffer，其缓冲能力最强 ，
磷酸盐缓冲体系
For most biochemical purposes, pKa2 is of greatest interest－Why？
Байду номын сангаас
方案1 方案1
• 磷酸盐缓冲液 （ 1/15 mol/L， pH7.5 ） ： 600mL ， 1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）与400mL 1/15 磷酸氢二钠（ 磷酸氢二钠 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。 磷酸二氢钠（ 磷酸二氢钠 ）混匀。
→1L 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4缓冲液、pH7.5 buffer A 缓冲液、
4、生物法破碎 、
• 原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到 原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞， 部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜， 部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜， 进一步增大胞内产物的通透性 • 优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及 优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、 pH等外界条件要求低 不残留细胞碎片等， pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细 等外界条件要求低， 胞壁结构决定了需要不同的酶 •溶菌酶lysozyme适用于G＋的细胞壁，若配合EDTA、TritonX溶菌酶lysozyme适用于 的细胞壁，若配合EDTA、TritonX适用于G 100则可有效作用于 的胞壁； 100则可有效作用于G－的胞壁； 则可有效作用于G •真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖 葡聚糖酶或 真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶 酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶 破坏植物细胞壁需用纤维素酶
4、生物法破碎 、
• 自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱 自溶：通过调节温度、 或添加有机溶剂等激活剂 或添加有机溶剂等激活剂， 使细胞产生溶解自身酶的方法
• 溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法 溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法 • 但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用， 但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用， 高成本 使该法不可能实现大规模应用 esp.G-的酶溶更受到了限制