107670-生物制药工艺-13.5 糖类药物

（2）工艺过程
①浸泡提取、碱化、中和 自来水室温浸泡2-3h，浸泡 液用30%NaOH调pH10-11，静置8h，凝集沉淀多糖类粘性 物；虹吸上清液，用1∶1 H2SO4中和至pH6-7，进一步除去 胶状物，得中性提取液。
②浓缩、沉淀 浓缩中性提取液，除去NaCl和胶状物，直 到浓缩液含甘露糖30%以上，冷至60-70℃加入2倍体积95% 乙醇，搅拌均匀，冷至室温离心收集灰白色松散沉淀物。
三、肝素
（一）结构与性质
是三硫酸双糖与二硫酸双糖以2∶1的比例在分子中交替联结而 成的。其分子结构有一个六糖重复单位（p515）；整个分子呈螺 旋形纤维状。分子量不均一，平均分子量12000±6000。肝素及其 钠盐为白色或灰白色粉末。分子中含有硫酸基和羧基，呈强酸性； 肝素具有聚阴离子性质，能与多种阳离子反应成盐。肝素与碱性 染料如天青A、甲苯胺蓝等反应可使染料的光吸收向短波方向移 动。
（三）检验方法 硫酸软骨素的检验方法一般有：
（1）比色法 （2）重量法 （3）定氮法 （四）作用与用途
五、透明质酸（522）
本章思考练习：
1、简述多糖分离纯化的方法。 2、糖类药物主要有哪些？ 3、多糖类药物一般具有哪些生理功能？ 4、工业上D-甘露糖的生产工艺如何？ 5、简要描述1,6-二磷酸果糖生产的工艺过程。 6、肝素生产的工艺路线如何？ 7、工业上稀碱-酶解法生产硫酸软骨素的工艺过程大 致如何？
②盐解：上述提取液用2M HCl调pH7-8，升温至90℃、20min， 冷却过滤。
③除酸性蛋白：将盐解液调pH2-3搅拌10min，精置后过滤，滤 液调pH6.5，加去离子水调节NaCl为1M左右。
④沉淀：在上述溶液中加入95%乙醇，使乙醇浓度为60%，沉 淀过夜。
⑤干燥：收集沉淀，用乙醇脱水，60-65℃真空干燥，得成品硫 酸软骨素。
肝素可被肝素酶降解为三硫酸双糖单位和二硫酸双糖单位。
硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝血活性；高度乙酰 化的肝素，抗凝血活性降低甚至完全消失，而降脂活性不变。小 分子量肝素（4K—5K）具有较低的抗凝活性和较高的抗血栓形 成活性。
（二）生产工艺
肝素在组织内和其他粘多糖一起与蛋白质结合成复合物， 因此，肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取、解离和肝 素的分离纯化两大步。解离可以用盐解离法和酶解离法。
二、1，6 -- 二磷酸果糖
（一）结构与性质 钠盐为白色晶型粉末，易溶于水，4℃较稳定。 （二）生产工艺 1、酶转化工艺 （1）工艺路线
（2）工艺过程
①取经多代发酵应用过的酵母渣，悬于适量蒸馏水，反复冻融3 次，加入底物（8%蔗糖，4%NaH2PO4，30mM MgCl2，pH6.5） 于30℃反应6h。
⑥转酸：FDPCa悬于无菌水中，用732-[H+]树脂将其转成 FDPH4，用2M NaOH调pH5.3-5.8，经活性炭脱色，超滤冻干， 得FDPNa3H精品。
（三）检验方法：酶分析法
（四）作用与用途
用于治疗急性心肌梗塞、心功能不全、冠心病、心肌缺血发 作休克等症的急救药物；对各类肝炎引起的深度黄疸、转氨酶 升高及低白蛋白血症也有较好的治疗作用。
第十三章(5)
糖类药物
第一节 糖类药物制备的一般方法
一、单糖及其衍生物的制备
一般用水或者乙醇作为溶剂进行提取，然后经过脱色、浓 缩、冷却、析出晶体；也可以用层析法。
二、多糖的分离与纯化
（一）多糖的提取 一般材料先进行脱脂、脱水预处理，然后可选用下列方法提取： 1、难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者
用稀碱液提取 2、易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者
冷水浸过后，热水提取；也可加热搅拌提取
3、粘多糖
由于粘多糖与蛋白质结合在一起，需用酶解法或碱解法使糖 -蛋白间的结合键断裂，促使多糖释放。一般组织中有多种粘多 糖，还需要进一步分离不同粘多糖，方法有乙醇分级沉淀法或层 析法。
（1）碱解法
用0.5M NaOH在40℃溶解组织并提取，提取液以盐酸中和， 透析后用高岭土等吸附剂除去蛋白，再用乙醇沉淀多糖。此法一 般不破坏多糖分子中的硫酸基。
利用粘多糖与一些表面活性剂络合成难溶季铵盐。 （4）离子交换层析法
主要利用阴离子交换剂。

第二节 糖类药物
糖类药物主要有：
➢单糖 如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等；
➢低聚糖 如蔗糖、麦芽糖乳糖、乳果糖，多糖如右旋 糖苷、香菇多糖、茯苓多糖等；
➢糖的衍生物 如6-磷酸葡萄糖磷酸肌醇等。
糖类药物研究的最多的是多糖类药物，一般都是天 然动植物组织内直接提取，如黄芪多糖、人参多糖、 麦麸多糖、银耳多糖、灵芝多糖、云芝多糖、酵母多 糖、硫酸软骨素、透明质酸、几丁质、胎盘脂多糖等。
②除杂蛋白：煮沸5min，离心去除杂蛋白，收集清液。
③阴离子交换柱层析：转化液通过DEAE-C交换柱，先用蒸馏水 洗涤至pH7.0，然后进行分步洗脱。
④转酸：FDPCa悬于水中，用732-[H+]树脂将其转成FDPH4，用 2M NaOH调pH5.3-5.8，除菌过滤后，冻干。
2、固定化细胞制备工艺 （1）工艺路线
粘多糖基本上是由特殊的重复双糖单位构成，在此双糖中， 包含一个N-乙酰氨基己糖。
两种糖醛酸：D-葡萄糖醛酸和L-艾杜糖醛酸；两种氨基己糖： 氨基-D-葡萄糖和氨基-D-半乳糖。
第三节 重要糖类药物生产工艺
一、D-甘露醇
（一）结构与性质 又名己六醇，为白色针状晶体，略有甜味，不潮解；易溶于
水。 （二）生产工艺 1、提取法 （1）工艺路线
2、稀碱-酶解法 （1）工艺路线
（2）工艺过程 ①提取：软骨粉碎，用2%NaOH浸泡提取。 ②酶解：提取液用1∶1HCl调pH8.8-8.9，升温至50℃；加入1/25量 的胰酶，于53-54℃保温6-7h。 ③吸附：用1∶1HCl调pH6.8-7.0，加入活性白陶土和活性炭，搅拌 吸附1h，再用HCl调pH6.4，过滤。 ④沉淀、干燥：调pH6.0，95%乙醇沉淀（终浓度75%）8h以上， 收集沉淀，60-65℃真空干燥。
1、盐解-离子交换生产工艺
（1）工艺路线
（2）工艺过程
2、酶解-离子交换生产工艺 （1）工艺路线
（2）工艺过程
（三）检验方法
（四）作用与用途（p518）
(五)小分子肝素(p518)
四、硫酸软骨素
（一）结构与性质
（二）生产工艺 1、稀碱-浓盐法 （1）工艺路线
（2）工艺过程
①提取：软骨粉碎，用3MNaCl浸泡，50%NaOH调pH12-13， 室温搅拌10-15h，过滤。
③精制 沉淀物悬于8倍体积95%乙醇中，搅拌回流半小 时，冷却过夜，离心得粗品甘露醇，含量70%-80%。重复 一次，经乙醇重结晶后，含量＞90%，氯化物含量＜0.5%。 重溶于蒸馏水中，加入1/8-1/10活性炭，80℃保温0.5h，滤清。 清液冷却至室温得结晶，抽滤，洗涤得精品甘露醇。
④干燥、包装 结晶甘露醇于105-110℃烘干，冷却、包装。
2、发酵法 （1）工艺路线
（2）工艺过程 ①菌种选育 ②种子培养 ③发酵 ④除杂质、分离结晶 ⑤浓缩、结晶、烘干、包装
3、制剂 （三）检验方法 1、pH值：注射用pH值应为4.5-6.5； 2、含量测定：碘量法测定甘露醇含量。 （四）作用与用途 治疗脑水肿引起的休克、防止肾脏衰竭、治疗青光眼、中毒性 肺炎等。
（2）工艺过程 ①FDP产生菌的培养：菌株为啤酒酵母 ②固定化细胞制备：菌液与加热熔化的卡拉胶混匀，冷却成型， 切块即可。 ③活化固定化细胞：用含底物的表面活性剂于35℃浸泡活化。 ④酶促转化：活化的固定化细胞装柱，30℃底物溶液流过活化。
⑤离子交换：反应液经除蛋白后过滤，滤液通过DEAE-C阴离 子交换柱，经洗涤、洗脱，收集洗脱液，加入适量CaCl2使生 成FDPCa沉淀。
（2）酶解法
比较常用。而且常与碱解法联用。
（二）多糖的纯化
（1）乙醇沉淀法 此法是制备粘多糖最常用的方法。供乙醇沉淀的多糖溶液
浓度以1%-2%为佳。同时向溶液中加入一定浓度（如5%） 可有助于多糖的析出。 （2）分级沉淀法
不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同， 因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多 糖。 （3）季铵盐络合法（p388）
多糖类具有多种生理活性：
（1）调节免疫功能 影响补体活性，促进淋巴细胞增殖等 （2）抗感染作用 提高身体免疫力 （3）促进细胞DNA、蛋白质的合成，促进细胞增殖、生长 （4）抗辐射损伤作用 抗氧化、防辐射作用 （5）抗凝血作用 如肝素是天然的抗凝剂 （6）降血脂、抗动脉粥样硬化作用 如类肝素硫酸软骨素等 粘多糖：是指含有氨基己糖与糖醛酸的多糖，也叫酸性粘多糖。