葡萄组培

葡萄组织培养及试管快繁技术

引言：葡萄(学名：Vitis vinifera)是多年生藤本浆果果树，果实美观艳丽，肉质柔软多汁、酸甜可口，营养价值极高，是人们喜食的鲜食水果。葡萄还可用于酿酒、制干、制汁等，是重要的食品加工原料。加之其适应性强、丰产果实，又是美化庭院楼阁、绿化荒山、碱滩的观赏和绿化树种。我国绝大多数省、市、自治区均能栽培葡萄，以及新疆、山东、河北、辽宁为多。2011年6月，宁夏玉泉营苗木繁育中心被自治区命名为宁夏葡萄苗木工程技术研究中心，建立了葡萄组织培养实验室。从2011年8月起，中心实验室技术人员克服种种困难开展了组培工作，经过三次无菌材料的采集、消毒和接种，于2011年10月20日成功培养出了11株葡萄试管苗，取得了无毒苗繁育的重大突破，填补了农垦及宁夏无毒葡萄苗自繁自育的空白。这些试管苗通过继代培养，目前已快速繁殖达到4600株(2400瓶)。葡萄组培苗接种的实验成功和快建繁殖为优质葡萄种苗的繁育和宁夏贺兰山东麓葡萄产业的发展起到了引领推动作用。

表1.MS培养基母液的配制

洗洁净等洗涤。洗净的器皿应不挂水珠，内外壁水膜均一，置于烘箱内烘干 .新购置的玻璃器皿或多或少含有游离的碱性物质。使用前先用1%的盐酸浸泡一夜，再用清水冲洗。蒸馏水冲洗一遍干后备用即可。已污染的玻璃器皿则必须在121℃高压蒸汽灭菌30分钟后，倒去残渣用毛刷刷去管壁上的培养液和菌斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲洗一遍晾干备用。切记不可直接用水冲洗，否则会完成环境污染。

2配制母液和激素。根据表1配制1到4号母液，将母液分装在4个溶液瓶中。配置好的母液分别贴上标签，注明母液名称，配置背书以及日期。储存时间不易过长，无机盐最好在一个月内用完，当母液中出现霉菌或沉淀时，母液不可使用。注意铁盐要单独配。将BA,IAA,IBA,NAA 用少量醇溶解再用水稀释至所需浓度。

3配制培养基。①将母液按比例取出相应体积后按顺序注入烧杯中。②加入蔗糖，蔗糖溶解后加水定容至1L。③使用酸度计调节 pH 值为 5.8。调节用试剂为1mol/L的盐酸和氢氧化钠。④加入琼脂，并加热溶解，边加热边搅拌，以免造成糊底。

4分装灭菌。配制好的培养基应尽快分装在编好号的锥形瓶中。分装的方法有虹吸试分注法和直接注入法等。分装时要掌握好培养基的量，一般占试管，锥形瓶等培养容器的1/4～1/3为宜。分装时注意不要将培养基沾到管口，以免引起培养基污染。加入不同浓度的激素溶液，尽快用封口膜封好口，以免水分蒸发。常用材料有棉花.硫酸纸.耐高温塑料薄膜等。封好口的培养基尽快用高压灭菌锅灭菌，灭菌不及时杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。一般灭菌温度为121℃保持20 分钟。灭菌后，切断电源，使灭菌器内的压力缓慢降下来，接近0时，才可以打开放气阀，排出剩余蒸汽后，打开锅盖，取出培养基。若切断电源后，急于取出培养基而打开气阀

5外植体选择和消毒。剪取污染较少且健壮无病的葡萄嫩枝，除去幼叶，剪成一定长度带有芽的茎段，自来水冲洗2~3小时，置冰箱处理4小时，这样有利于材料的诱导再生。将处理后的材料用自来水反复浸泡冲洗，清晰材料表面的尘土和附着的微生物。在超净工作台上，将处理好的葡萄带芽的茎段，用70%酒精浸泡消毒15~20秒，因葡萄对酒精敏感，酒精消毒不宜超过20秒。再用0.1%升汞浸泡5~10分钟，无菌水冲洗4~5次，以彻底清除升汞。

6接种前准备及接种。将接种所用器具先消毒，操作人员和超净工作台用酒精消毒，晾干后进行接种操作。用消毒过的器械将外植体置于培养皿上，切取所需的外植体。将外植体接种于培养容器的培养基上，整个试验在超净工作台上进行，保持无菌。

7初代培养。消毒处理后的茎段放在灭过菌的培养皿内的滤纸上,水吸干后,再用剪刀剪去两端接触药剂的部分,并剪成长度为2~3厘米单芽茎段,插入初代培养基中(BA0.5~1.0mg/L+IAA0.1~0.3mg/L)。将接种好的培养瓶放置在暗处1天,然后再移到培养室内进行培养。培养温度为28士1℃,光照强度为2000~2400勒克斯,光照时间12~14小时/天。两周左右可看到有许多绿色的芽点和小的不定芽出现，再过一段时间就会长出丛生芽。

8继代培养。将愈伤组织重新转移到新鲜培养基上的过程称为继代。从初代培养基选取较大的不定芽，转接到继代培养基上(BA0.4~0.6mg/L)，三周左右，小芽即可长成4cm左右高的无根苗。葡萄在此培养基中生长繁殖很快，每4周可繁殖5倍左右。

9生根培养。从已经继代的瓶苗中选出3~4cm高的壮苗，在无菌滤纸上用解剖刀从瓶苗基部切去3~5cm，将小苗转到1/2MS生根培养基上(IBA或NAA0.1~0.3mg/L)。生长10小时后，有一些苗的基部长出白色的突起，再过30小时后，这些突起可以发育成0.5cm以上的幼根，生根率可达90%以上。

10炼苗移植。成苗后将培养瓶移到温室内,放在自然光下进行锻炼,室温要求在10~28℃。经5、8天后再将瓶塞揭开,使之在接近自然温、湿度及日光下锻炼4、5天,便可移栽到温室。用罐头瓶做培养瓶的,揭开盖子锻炼时,应当用塑料膜罩_卜一逐渐揭膜放风、防止叶片风干。在温室栽种,移栽时一将锻炼好的小苗取出,用水洗去培养基,直接栽入砂壤中。从移栽开始到移栽完毕,要不断地往小苗土啧水,避免叶片风干,移栽完毕,一次浇透水,搭好拱棚,罩上薄膜,湿度保持在90%左右,应遇强阳光照射时,最好用纸遮盖拱棚,避免棚内温度过高抑制葡萄苗的生长,15天后可以逐渐揭膜放风。具体做法是首先在棚的上方打几个拳头大小的孔,几天后在棚的侧面再打几个孔,以增强棚内风的对流,降低棚内湿度和温度,使葡萄苗逐渐适应周围自然环境,最后将棚的两头揭开直到膜全部撤掉。在此阶段中,要及时浇水,保持土壤湿润。温度以8~25℃为宜。葡萄苗移栽成活率可达80%以上。

11假植。小苗在温室生长1个月左右,便可假植到田间。假植时,用小铲在离小苗4~5厘米周围铲出小方佗,带土移植到田间,一次浇透水,成活率100% 。

12田间管理。葡萄苗在田间生长较快,要注意勤灌水、施肥,并及时插竹杆,以利葡萄苗尽快攀绕而上,避免伏地相互缠绕。在进入7月份后要注意喷药,防治病虫,每隔10~15天喷洒一次波尔多液。

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