流动注射化学发光联用技术讲义

实验 2、流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐 酸环丙沙星含量的研究
[实验目的] 1 掌握流动注射技术的基本原理以及化学发光分析法的基本原理 2 熟悉流动注射-化学发光分析系统的工作原理及仪器使用方法 3. 掌握流动注射化学发光法测量盐酸药片中盐酸环丙沙星含量的方法。
[实验原理] 化学发光(chemiluminescence)是指某些化学反应中发出可见光的现象。其发
光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物，中间体或者荧光物质吸收了 反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后从激发态回到基态，同时将能量以 光辐射的形式释放出来，产生化学发光。
图 1 化学发光发生的反应过程
直接化学发光
间接化学发光
流动注射技术（Flow Injection）：原始的手工操作和现代化的检测仪器共存，

严重阻碍了先进检测仪器更好的发挥作用；同时分析过程中的试验处理往往占去 整个分析时间的 90%，这种状况自然不能满足现代分析化学的要求。流动注射法 是为解决这一矛盾在 70 年代中期出现的溶液处理技术的新观念。其主要特点包 括：①广泛的适应性：可与多种检测手段联用；②高效率：100-300 样/h，复杂 的分析过程也能达到 40-60 样/h; ③低消耗：10-100µL/测定；④高精度：0.5% 1 %RSD,复杂的在线处理，测定精度可达 1.5%-3%RSD；⑤设备简单、价廉。
流动注射分析装置包括：液体传输设备；注样器；反应器；流通式检测器和 信号读出装置。液体传输设备主要指蠕动泵；注样器是十六通注样阀；化学发光 检测的反应器和流通式检测器合并为流通式盘管。
盐酸环丙沙星属于第三代喹诺酮类药物，抗菌能力强，临床广泛用于革兰氏 阳性菌和革兰氏阴菌引起的感染，对 内酰胺抗生素、氨基糖苷类以及四环素等 多重耐药菌具有较好的抗菌活性。测定盐酸环丙沙星的分析方法主要有高效液相 色谱法、毛细管电泳法、分光光度法 、电位法嘲、极谱法等。研究表明：在酸 性条件下，盐酸环丙沙星对 Ce4+-Na2SO3 化学发光体系具有强的增敏作用，据此 建立了盐酸环丙沙星的流动注射分析法。本方法具有分析速度快，仪器设备简单， 灵敏度高等优点。用于药片中盐酸环丙沙星含量的测定，加标回收结果令人满意。
[仪器试剂] BPCL 微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2D 恒流泵（上
海青浦沪西仪器厂）；八通阀（杭州）；联机计算机。 硫酸铈溶液：4.0 × 10-4 mol/L（用 0.05 mol/l 硫酸溶解）；亚硫酸钠溶液：8.0 ×
10-2 mol/l；盐酸环丙沙星标准溶液：100.0 mg/L(用 0.04 mol/l 盐酸溶解)；盐酸环 丙沙星滴眼液（规格及产家待定）
所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。
[装置和流路]

图 1 流动注射-化学发光系统示意图
Figure 1 Diagram of Flow-injection -chemluminescence system
P.
; V.
液(waste); PMT.
computer)。
; F.
; M. 混合三通(mixture); W. 废
; HV.负高压(high voltage); PC. 联机电脑 (personal
a:
; b:
; c:
[实验步骤] 1. 仪器预热 (1)接通计算机电源，启动windows 系统；打开BPCL主机电源，仪器预热30min 以上，选择所需温度及负高压。打开快门（探测器样品室又下方旋钮：指示柄端 头位于红色标记处，快门打开；绿色标记处，快门关闭）不能使探测器顶盖和快 门同时处于开启状态，否则会损坏探测器中光电转换器！开启BPCL测量程序， 设定参数后启动测量。
(2)清洗流路：开启蠕动泵，旋紧蠕动泵上面及两侧的4个旋钮（力度相同保证流 速同一流速下的样品进样速度一致），选择蠕动泵转向（方向错误将导致蠕动泵 卡住），打开蠕动泵，选择流速（可以用60rpm）。按图1组装流路，用0.1mol/L 硝酸清洗流路，而后用0.1mol/LNaOH清洗流路，最后用二次蒸馏水清洗，直到 基线稳定（基线信号值和所加负高压相关，当副高压为-750V时，基线在100单位 化学发光信号为合适）。
2.数据测量

(1)用100.0mg/L(用0.04 mol/L盐酸溶解)的盐酸环丙沙星储备液，配置浓度为 0.1-10mg/L的盐酸环丙沙星标准溶液系列。 (2)标准曲线的绘制：按图一流路测量，启动泵（流速为60rpm），将Na2SO3溶液 与盐酸环丙沙星溶液混合后，通过流动泵注入作为载流的酸性硫酸铈溶液中，微 弱发光仪检测及纪录发光强度信号。重新启动测量程序，开始检测。首先测量空 白溶液，按相同时间间隔（15s）旋转八通阀，得到信号峰，平行测量三次，标 准系列由稀到浓进行测量，操作同空白，得到一条时间-峰值图，完成检测后选 择停止检测，保存，导出为.txt或.Xls文件后，导入origin处理。绘制浓度-峰值标 准曲线，线性拟合得浓度-峰值关系式。 (3)盐酸环丙沙星滴眼液（规格5ml：15mg（按环丙沙星计）湖北东盛制药有限公 司），按标示稀释为10mg/L的浓度，按（2）操作先走空白，空白的峰值和标准 曲线相近，测量理论浓度为10mg/L（按环丙沙星计）的药片，均平行测量三次， 完成检测后选择停止检测，保存，导出为.txt或.xls文件后，导入origin处理。读 出峰值，按浓度-峰值关系式求出药片中的实际盐酸环丙沙星含量。
3.清洗流路 (1)清洗流路（同上面方法，最后将管中二次蒸馏水全部走光，保证管不被腐蚀）， 关闭快门旋松蠕动泵旋钮，关闭BPCL主机。 (2)关闭电脑，洗净试剂瓶，容量瓶，清洁台面，关闭实验室电源方可离开。
[实验数据] 1 静态法测动力学曲线
采用分立取样式，研究该体系的化学发光反应动力学曲线，即记录在反应物 部分混合后，发光强度随时间的变化曲线。观察化学发光强度随时间的变化情况。
（请绘制出发光强度 I-时间 t 图，并解释之）
2 体系条件优化 2.1 硫酸铈浓度的影响