感受态细胞和质粒DNA的转化(C)

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大肠杆菌(Escherichia coli)
大肠杆菌(Escherichia coli)大约含 3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。 革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度 37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加 甘油，培养皿密封。
大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生
长滞后期)、对数生长期(20~30min)、
HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL） X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）
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④ 细菌培养管取出置水浴中，10~15分钟。 ⑤ 细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清， 留沉淀置于冰浴中。 ⑥ 加0.1mol/L CaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中 20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。 ⑦ 4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。 ⑧ 用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。 可直接使用。 ⑨ 次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。 ⑩ 分装成每Eppendorf管200uL。
高压灭菌
Phagemid
-20℃
Enzyme
-20℃
Buffers
-20℃
Primer
-4℃
Thiodeyivatives
-20℃
Ribonucleotides
-20℃
Helper phage
-4℃
置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次
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抗生素的配制
抗生素
工作浓度
松驰型质粒
严紧型质粒
感受态细胞和质粒DNA的转化
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重组DNA分子导入受体细胞
导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法
重组DNA导入哺乳动物细胞:
DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法
酵母菌转化法:
完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法
新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体 部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。
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两种假设：
① CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞 壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁， 俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。
大肠杆菌感受态细胞制备和贮存
在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体 DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA 复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌 宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大 肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆 菌缺乏天然的转化机理。1970年M. Mandela 和A. Higa提 出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌， 能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞 称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转 化频率。目前对这种机制尚不清楚。
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水）
60ug/mL
20ug/mL
氯霉素(Cm)
34mg/mL（乙醇） 170ug/mL
卡那霉素(Kan) 50ug/mL（水）
50ug/mL
链霉素(Sm)
10mg/mL（水）
50ug/mL
四环素(Tc)
5mg/mL（乙醇）
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50ug/mL
25ug/mL 10ug/mL 10ug/mL 10ug/mL
稳定期(饱和期)，约1×109
~2×108/mL和衰老期。
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2. 菌株的保存
大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株 在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同 条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株 比大肠杆菌X1776株保存期长。
所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再 做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生 长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。
② CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的 酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受 态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来 DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长 对数期的后期。
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感受态细胞(Compenent cells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化
到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。 (主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)
① 取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜 (一般16小时)。 ② 取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振 培养，过夜(8~16 小时)。 ③ 取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。 37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)， OD550达0.3~0.5。 注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值 间关系不同。
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具体保存方法： ① LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成 单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔 绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。
E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中， 4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。
② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。
③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入1050%甘油培养基中，分装，置-20～ -70℃。可经过30次冻融， 细菌仍然存活。
菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速 冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。
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菌株保存液的配制
琼脂穿刺培养基
2×冰冻培养基
琼脂（Difco）
6g
K2HPO4
细菌胰蛋白胨 （Difco）
10g
N++-柠檬酸
12.6g 0.19g
NaCl HCl ddH2O
8g 20mg 至1L
MgSO4＞H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油
-- 精品-- dH2O
0.18g 1.8g 3.6g 88g 至1L