培养基的配制与灭菌

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三 实验材料
•
药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蔗糖；可溶性淀 粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O等。 高压蒸汽灭菌锅、恒温干热灭菌箱、超净工作台。 其它：天平、牛角匙、电炉、1MHCl、1MNaOH、pH试纸、 刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、玻璃珠、三角
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过滤除菌
不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血 清），一般可用细菌过滤器进行除菌。
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紫外线灭菌法
紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200-300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在 波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘 积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶 二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另
称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
调pH值：用1MNaOH或1MHCl调pH，用pH试纸对照。
加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确
定无菌生长，方可使用。
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几种常用培养基配方
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 3.0g 10.0g 5.0g
水
pH
1000ml
7.4～7.6。
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高氏Ⅰ号培养基配方如下：
可溶性淀粉 20g
NaCl
KNO3 K2HPO4· 2O 3H MgSO4· 2O 7H FeSO4· 2O 7H 琼脂 水 pH
• •
瓶、带塞子的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、
各种包装纸、防水纸、标签等。
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四 实验步骤
1. 2. 3. 4. 5.
称量 溶化 调pH 过滤 分装
6. 加塞 7. 包扎 8. 灭菌 9. 搁置斜面 10. 无菌检查
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• • • • • • •
•
•
能。
• • •
生长素：微生物生长必需，但又不能自行合成的有机物。 无机盐：提供微生物繁殖所需各种重要元素。 水分：水是保证生命活动重要的介质。
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培养基的种类
据组成成分可分为:
1. 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
（如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。）
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每一小组讨论所有的实验哪 些耗材需要灭菌？实验前都 该做哪些准备工作？
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培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组
分的营养物质调制而成的营养基质。
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营养六要素
•
碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的营养物质。用途：糖、 蛋白质、核酸合成。 氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的营养物质。用途：蛋 白质、核酸合成。 能源：提供微生物生命活动最初能量来源的营养物或辐射
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六 思考题

1.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 2.在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的 冷空气完全排尽？
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一、自生固氮菌的分离纯化
1、富集培养（下周上课时自带土壤——偏碱性土壤） 一组5人，每人做1皿（共5皿，灭菌时5个一包）； 需要1瓶阿斯毕培养基倒平板（100ml左右） 2、划线分离 每人做2皿（共10皿，灭菌时10个一包）； 需要2瓶阿斯毕培养基倒平板（200ml左右） 3、斜面保藏 每人保藏2根斜面（共10根）. 配培养基时做好10根阿斯毕无氮培养基斜面。
酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降
落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内 的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再 开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目 的。
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化学药品灭菌
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高 锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔 灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
0.5g
1g 0.5g 0.5g 0.01g 15～25g 1000mL 7.4～7.6
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马铃薯培养基配方：
马铃薯 葡萄糖 琼脂 200g 20g l5～20 g
蒸馏水
pH
l000mL
自然
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阿斯毕无氮培养基：
甘露醇（或蔗糖、葡萄糖）
KH2PO4 MgSO4.7H2O NaCl CaSO4.2H2O
加热灭菌——干热灭菌

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而 达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受
热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快， 反之含水量越少，凝固缓慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～ 170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过
一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧
化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢 （H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，
所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体
表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。
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为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以 前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭
中驱尽，然后关闭排气阀，继续 加热，此时由于蒸气不能溢出，
而增加了灭菌锅内的压力，从而
使沸点增高，得到高于100℃的 温度。导致菌体蛋白质凝固变性 而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀 菌效力比干热大。其原因 有三：一是湿热中细菌菌 体吸收水分，蛋白质较易 凝固，因蛋白质含水量增 加，所需凝固温度降低， 二是湿热的穿透力比干热 大，三是湿热的蒸气有潜 热存在。这种潜热，能迅 速提高被灭菌物体的温度， 从而增加灭菌效力。

选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的 特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的 一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从 混杂的微生物群体中分离出来。
鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反 应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化， 以区别不同的微生物
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二、土壤平板稀释计数
1、梯度稀释（下周自带10g以上的土壤） 一个带玻璃珠的250ml三角瓶，内装90ml蒸馏水； 6个装有9ml蒸馏水用于梯度稀释的18*180试管； 1ml移液管1支。 2、涂平板 5个人每人做1个浓度，每个浓度做3个重复，即 每个浓度涂3皿（共15皿，灭菌时6个一包，9个 一包） 需要3瓶牛肉膏蛋白胨培养基倒平板（300ml左右） 3、每天都要有人来观察计数，具体计数规则见实验 指导。
180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃
烧。
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湿热灭菌
高压蒸气灭菌是将待灭菌的
1g水在100℃时，由气态变 为液态时可放出2.26kJ(千 焦)的热量。
物品放在一个密闭的加压灭菌锅
内，通过加热，使灭菌锅隔套间 的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气
急剧地将锅内的冷空气从排气阀
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实验一 培养基的配制与灭菌
一 实验目的
• •
了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽 灭菌法的原理及其使用方法。
•
熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作 方法。
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二 实验原理

人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个 良好的营养条件。
凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。
3. 半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.5%
凝固剂而成的半固体状培养基。
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按照培养基的用途，可将其分为：

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加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血 清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子） 的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求 苛刻的异养微生物
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因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨 胀压，所以，当水蒸气中含有空气
时，在同一压力下，含空气蒸气的
温度低于饱和蒸气的温度。
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一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～ 30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度 及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等 具体情况而有所改变。
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蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时 严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品，或称取一种药 品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢 出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。 分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免污 染棉塞而引起污染。 分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约 为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶 的装量不超过瓶体的1/2 。
10g
0.2g 0.2g 0.2g 0.1g
CaCO3
琼脂 水
5g
20g 1000ml
PH 自然
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五 注意事项

在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气要尽可能 排除完； 易燃易爆物品（如：硝化甘油、硝化纤维、黄磷、红磷、 乙醚、汽油及可燃性气体等）不能用高压灭菌法灭菌； 当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔 体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴。 否则它们会带来腐蚀和变质。要检查压力表上的指数为 “0Mpa”后才能打开锅盖。 外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否则会引起装 臵故障、起火、短路。
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培养基 灭菌
配制培养的各类营养物质和容器等含有各种 微生物

微生物生长繁殖：

消耗养分


改变培养的酸碱度
产生毒素或者抑制物
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灭菌方法
• 加热灭菌
• 干热灭菌
• 湿热灭菌
•
过滤除菌
•
辐射灭菌
• 放射线辐照灭菌 • 紫外线灭菌
•
化学药品灭菌
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2. 半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然 物质配制而成。（如马铃薯蔗糖培养基。） 3. 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 （如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。）
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从培养基的物理状态可分为
1. 液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂） 的液体状态培养基。 2. 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的