基因工程蛋白质类药物

• 是对红细胞的生成有增强作用的体液性因子。为分子量67万的糖蛋白，糖的含量多，已证明血和尿中都有它的存 在。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞 （erythropoietin responsive cell），促红细胞生成素在此 发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红 血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管 等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组 织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾 脏贫血时其含量则非常低。其生成器官和机制虽尚未清楚， 可是作为某肾脏因子（renal erythropoietic factor）与血 浆的基质反应产生肾小球的说法是有力的。此外，起着相 当于促红细胞生成素作用的因子中，促进白细胞生成的有 colony stimulating factor，促进血小板生成的为促血小板 生成素，包括促红细胞生成素在内，统称为造血促进因子。
用途
• 医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织 断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。
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体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负
荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年
北京奥运会中第一例的兴奋剂
•
检查呈阳性的西班牙自行车选手玛丽亚·莫里
诺，就是被发现使用使用促红细胞生成素(EPO)，
国际奥委会于2008年8月11日宣布
基因重组人促红细胞生成素
（erythropoietin,EPO）
• EPO是最早发现并首先运用于临床的造血生长因 子， 1985年成功表达了重组人促红细胞生成素 (rhEPO)。rhEPO成为当前研究开发最成功的基 因工程药物。
• EPO是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合 成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于红系祖细胞 的造血生长因子，对神经元的许多功能也具有重 要的调控作用。
• CHO细胞表达系统 ：CHO细胞表达系统能准确进行转录 后重组蛋白的加工修饰，表达的糖基化蛋白在分子结构 和生物学活性方面与天然蛋白十分接近。 CHO细胞属于 成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，而表达的外源 产物是胞外分泌的，这样便于产物的下游分离纯化；在 CHO细胞内重组基因能高效扩增和表达；CHO细胞贴壁 生长，且具有较高的耐受剪切和渗透压能力，可以进行 悬浮培养。
• 人类 EPO 含有 166 个氨基酸 ,相对分子质量为34 400 , hEPO上有4个半胱氨酸(7,29,33,161),在7— 161，29—33之间以二硫键相连, 这对维持hEPO 的生物学活性有重要作用。糖基化对稳定 EPO 的 体内活性具有重要作用 ,若缺乏糖链 ,则 EPO 在 体内迅速被水解而失活。
• 人工化学合成的方法获得EPO基因：对部份氨 基酸序列进行修改
• 利用PCR技术扩增EPO基因：人胎肝中提取总 mRNA →RT-PCR技术克隆hEPO基因
重组人促红细胞生成素的表达系统
• 为了获得分子结构和生物学活性与天然 EPO相似的 rhEPO，选用哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞表达系统、非洲绿猴肾细胞COS7表达系统、 幼仓鼠肾（BHK）细胞表达系统。目前国内外首选CHO 细胞表达系统用来表达生产rhEPO。
• 昆虫细胞表达系统、乳腺表达系统
促红细胞生成素临床应用
• 肾功能衰竭所致的贫血：这种病只有靠连续输血 维持生命，但输血又使病人面临病毒感染和血过 量的危险。EPO右刺激红细胞生成，免去慢性肾 衰竭病人的输血。
• 癌性贫血：肿瘤引起的贫血或接受化疗、放疗所 引起的贫血。
• 结缔组织病贫血：类风湿性关节炎和红斑狼疮所 致的贫血。
• 研制rhEPO的主要环节包括: 获得人促红细胞生成 素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达 系统等。
获得EPO基因
• 构建基因组噬菌体文库克隆EPO基因 血细胞中提取基因组DNA→BamHⅠ酶切→回 收酶切片段→插入噬菌体EMBL3载体中→构建 基因组噬菌体文库→PCR方法从基因组模板中 扩增EPO基因片段为探针→筛选完整EPO基因 的插入片段→克隆
• 骨髓增生异常综合征贫血：促进骨髓造血状况改Fra Baidu bibliotek善。
重组人促红细胞生成素治疗的不良 反应
• rhEPO在治疗各种因素所引起的贫血中疗效是肯定的，并 且长期应用无毒性、无器官功能障碍、无过敏反应或抗体 形成。但是也存在一些副作用，最常见的是血压升高，有 的疾病治疗过程中还出现静脉血栓形成、出现高钾血症、 头痛、水潴留等。
基因工程蛋白质类药物
1
基因工程细胞因子类药物
2
基因工程肽类激素药物
3
重组溶血栓药物
4
基因工程酶类药物
5 重组可溶性受体和黏附分子
一、基因工程细胞因子类药物
• 细胞因子是指机体细胞合成和分泌的小分子多 肽类因子，它们具有调节机体的生理功能和免 疫功能，因而有可能利用基因工程技术进行生 产，用于治疗肿瘤、感染、免疫低下、造血功 能障碍等疾病。目前已研制成功或正在研制的 基因工程细胞因子类药物主要有促红细胞生成 素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干扰素（IFN）、 白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因 子、生长因子（GF）和凝血因子（F）等。
促细胞生成素的生物学作用
EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存 活、增殖和分化以调控红细胞的生成。
• 促进系祖细胞的增殖、分化和成熟 • 调控神经元部分功能 • 对细胞内钙浓度也有明显的调节作用
人促红细胞生成素基因重组
• 天然的 hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取 的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此， 在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝 中克隆出 hEPO基因, 并研制成功 rhEPO。1985 年美国FDA 批准rhEPO作为治疗肾性贫血的药物。
• 在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移， 出生后主要由肾小管间质细胞分泌 。EPO的产生 与机体供氧状况有关，低氧可刺激EPO的产生。
EPO的分子结构和功能
• 天然存在的 EPO 分为两种类型 , α型含 35 %的糖 基 ,β型含 26 %的糖基。两种类型在生物学特性、 抗原性及临床应用效果上均相同。
• 应该特别强调，虽然使用促红细胞生成素能提高红细胞的 含量，可增强人体的机能，但长时间或大剂量使用会产生 上述严重的副作用，千万不要将此药作为兴奋剂。国际奥 委会早在20世纪80年代就已宣布运动员禁用EPO来提高 运动成绩。但是近年来仍有一些运动员滥用rhEPO，成为 运动员中最为常用的兴奋剂之一。