高效液相色谱法培训课件

第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵,柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱;向后运动，将贮液瓶中液体吸入 缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断地 输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
废液
定量圈 1
废液
泵2
6
泵2
6
废液 5
废液 5
3
4
进样孔
柱
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
注意:使用后应清洗！
进样注意点
进样阀的废液出口端高度 必须与进样针在同一水平 位置,以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。
使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术,利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱,依据被分离组分分子尺寸与 凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类 似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内， 分子越大，保留时间越短。
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography)
表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时,多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
: , pH
的注 可不意
用能流 氨含动 水缓相 、冲必 醋盐须 酸，是 。若挥
注意
流动相 使用前
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。
例:硝酸、硫酸、盐酸、卤化物,
四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混
合物，含强络合剂的溶液等。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后,
冲洗 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
▪进样阀
定量圈 1
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术,可分为直接法和间接法两类:
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有:季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
例20l定量圈,进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。
进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
检测器
紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器
荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射 示差检测器 质谱
A
H
nm 光谱图
A-λ曲线 (定性)
min 色谱图
A-t 曲源自文库 (定量)
蒸发光散射检测器
是通用检测器,适用于无紫外吸收的化合物。
原理:组分先引入已通气体（N2,空气 ）的蒸 发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品 组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射光 强度而获得组分的浓度信号。
本法中流动相在检测前已蒸发,故梯度洗 脱基线稳定。
进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度, 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时, 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求:
不得超过定量圈体积的1/2量
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱,手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
高效液相色谱法
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础,引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
与气相色谱法相比具有:适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱 有:ODS( C18), C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值,抑 制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度， 改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。
以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液;流动相中不含有机溶剂。
因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)