核酸等温扩增ppt课件

SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的 环境中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的 依据，因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。

SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地 确保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假 阳性、假阴性结果。
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IMSA扩增
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IMSA扩增的原理
灵敏度高、特异性强、保真度高。
反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高、 须重复加入逆转录酶和 T7 RNA 聚合酶。
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滚环放大(rolling circle amplification, RCA)技术
基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同 温滚动复制的原理。
基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温 核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型 探针互补的重复序列。
RCA反应体系组成： 噬菌体 φ29DNA 聚合酶、单链环状 DNA 模板和引物 （一条或一对也可多条）。 噬菌体 φ29 DNA 聚合酶具备很强的链置换活性，无需模 板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成 DNA。
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RCA的扩增原理
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SAT技术
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）是将新一代 的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的 一种新型核酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高 特异性、低污染、反应稳定等优点。
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IMSA扩增的原理
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IMSA扩增的优点
IMSA 不仅拥有 LAMP 检测技术类似的应用 优点，在引物设计和扩增原理上还具有其独 有的特点，使得其具备比 LAMP 更高检测灵 敏度的潜力。
该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在 我国的应用限制，使其更好地服务于我国的 传染病防控、食品安全检测和环境物种保护 等各个领域。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
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引物、探针设计
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RPA技术的缺点
严格专利保护 反应成分复杂 对临床标本的检测效果较差
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谢 谢
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• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
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SAT技术的优势
针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特 异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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RPA技术
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RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年 由剑桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段 结合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20 分钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
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核酸等温扩增技术
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核酸等温扩增的优势
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核酸等温扩增的种类
4ห้องสมุดไป่ตู้
环介导核酸等温扩增技术（LAMP）
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LAMP引物设计原则
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LAMP扩增引物设计
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LAMP扩增过程
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环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核 酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000 个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进 入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和 这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可 由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。