枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化

枯草芽孢杆菌发酵培养基
及发酵条件优化
焉兆萍，宋士良，陆克文
(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)
中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05
枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。

该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。

枯草芽 孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。

由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。

本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。

1 材料与方法
1.1 供试菌种
枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。

1.2 培养基
LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。

1.3 种子液的制备
将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。

1.4 液体种子生长曲线的测定
将液体种子以1％接种量分别接入盛有100 mL种子液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h、26 h和27 h，分别取样测其吸光度(OD
600
)。

摘 要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。

采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚 铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。

最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5％，发酵温度35 ℃，摇床转速250 r/min。

关键词：枯草芽孢杆菌；发酵培养基；发酵条件
1.5 发酵培养基的筛选及优化
选择12种不同发酵培养基进行筛选，种子液以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min 摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵培养基[5-17]。

不同发酵培养基配方组成如下：
(1) 麦芽浸粉1 g/L、黄豆粉(过80目筛) 15 g/L、碳酸钙6.68 g/L、硫酸锰0.4 g/L、氯化镁2 g/L，pH 7.2。

(2) 可溶性淀粉10 g/L、酵母膏10 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、硫酸镁0.2 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。

(3) 玉米淀粉15.86 g/L、玉米浆干粉12.68 g/L、氯化铵19.98 g/L，pH 7.2。

(4) 蛋白胨30 g/L、甘油10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁1.5 g/L，pH 7.2。

(5) 玉米淀粉25.3 g/L、黄豆粉(过80目筛)49.5 g/L、酵母膏13 g/L、磷酸氢二钾1.1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、氯化钙0.1 g/L、硫酸锰0.1 g/L，pH 7.2。

(6) 葡萄糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸镁5 g/L，pH 7.2。

(7) 酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、蔗糖12 g/L、氯化钠5 g/L，pH 7.2。

(8) 玉米淀粉15 g/L、玉米浆干粉12 g/L、酵母膏1.5 g/L、氯化铵3 g/L、硫酸镁0.3 g/L、硫酸锰0.15 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。

(9) 蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉膏粉5 g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L，pH 7.2。

(10) 豆粕20 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉10 g/L，pH 7.0。

(11) 豆粕20 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米淀粉5 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸镁0.5 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L、硫酸锰0.2 g/L，pH 7.0。

(12) 玉米淀粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、豆粕10 g/L、硫酸铵0.5 g/L、碳酸钙1 g/L，pH 7.0。

1.6 发酵条件的优化
1.6.1 最佳培养温度的测定
采用筛选出的10号培养基，液体种子以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，分别在30 ℃、35 ℃、 37 ℃和40 ℃条件下，180 r/min摇床培养 72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳发酵温度。

1.6.2 最佳生长pH的测定
采用筛选出的10号培养基，发酵培养基初始pH分别调至6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，种子液以2％接种量接入盛有100 mL发 酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最佳初始pH。

1.6.3 接种量的影响
采用筛选出的10号培养基，将种子液接种量分别调节为摇瓶装液体积的1％、2％、5％、7％和10％，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适接种量。

1.6.4 装液量对细菌生长的影响
采用筛选出的10号培养基，种子液以2％接种量分别接入装有50 mL、75 mL、 100 mL、125 mL、150 mL液体发酵培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min摇床培养72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适装液量。

1.6.5 摇床转速对细菌生长的影响
采用筛选出的10号培养基，液体种子以2％接种量接入盛有100 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，37 ℃条件下摇床培养72 h，摇床转速分别设定为150 r/min、180 r/min、200 r/min和250 r/min，采用平板菌落计数法检测细菌总数，确定最适转速。

在确定好发酵培养基碳源与氮源的基础上，采用三因素三水平的正交试验表[L9(33)]进行试验。

种子液以5％接种量接入装有 50 mL初始pH 7.2液体发酵培养基的500 mL 三角瓶中，35 ℃条件下250 r/min摇床培养 72 h，采用平板菌落计数法检测细菌总数。

2 结果与分析
2.1 菌株生长曲线的测定
从图1可以看出，菌株在LB液体种子培
为养基中，37 ℃培养时间为23 h时的OD
600
最大值，因此选择培养23 h为液体种子生长
2.2 发酵培养基的筛选
培养基的筛选结果见表1。

从试验结果可以看出，10号培养基摇瓶培养，细菌总数最高值为40.5亿CFU/mL。

因此可选用10号培养基作为发酵培养基。

2.3 发酵条件的优化
2.3.1 培养温度对发酵菌数的影响
由图2结果可知，35 ℃培养发酵菌数最高，37 ℃次之，30 ℃和40 ℃条件下发酵细菌总数明显较低。

因此，选择35 ℃为最佳发酵温度。

2.3.2 初始pH对发酵菌数的影响
摇瓶发酵中pH难以控制，一般控制其初
菌数为35亿CFU/mL，初始pH 7.2时发酵菌数可达到39亿CFU/mL，明显高于其他初始pH的发酵菌数，因此选择适宜初始pH为7.2。

2.3.3 接种量对发酵菌数的影响
分别采用1％、2％、5％、7％和10％五个接种量梯度进行摇瓶培养，培养检测结果见图4。

由图4结果可以看出，一定范围内，发酵菌数随接种量的增加而增加，5％接种量
以上发酵菌数不再增加，因此5％接种量为最
适接种量。

2.3.4 装液量对发酵菌数的影响
由图5可以看出，装液量越多发酵菌数越
低。

枯草芽孢杆菌为需氧菌，在一定培养条件下，装液量越少发酵菌数越高。

因此选择最适摇瓶装液量为50 mL。

2.3.5 摇床转速对发酵菌数的影响
由图6可以看出，摇床转速越高发酵菌数越大。

转速小，通气量小，不利于枯草芽孢杆菌的生长。

因此该菌的适宜摇床培养转速为250 r/min。

2.4 发酵培养基的优化
碳源与氮源优化的正交试验因素水平 见表2，优化结果见表3。

从表中可以看出，发酵培养基中豆粕、葡萄糖和玉米粉的用量对枯草芽孢杆菌的生长均产生一定影响，从极差R 的大小来看，各因子作用的主次顺序
为A ＞C ＞
B，即豆粕的用量对菌体增殖的影
响最为显著，玉米粉次之，葡萄糖影响最小。

以发酵菌数作为评价指标，最佳表现组合为A2B1C2，即豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L 为碳源、氮源用量的最佳组合。

3 结论
由试验结果可知，培养温度、培养基初始pH、接种量、摇床转速等培养条件和发酵培养基的组成对菌株的生长有很大影响。

本文采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯
草芽孢杆菌的优化发酵培养基组成为：豆粕40 g/L、葡萄糖15 g/L、玉米粉20 g/L。

最适发酵条件为：发酵温度35 ℃，初始pH 7.2，接种量5％，摇床转速250 r/min。

采用此种配比发酵培养72 h 后细菌总数可达162亿CFU/mL，本试验结果为大规模工业化发酵生产提供了有益借鉴。

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参考文献：(17篇，略)
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