纳米抗体及其应用

纳米抗体及其应用

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

【摘要】自然界在骆驼体内存在缺失轻链的重链抗体, 克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段, 相对分子质量（Mr）仅为15000, 称为纳米抗体, 具有Mr小、稳定性强、可溶性好、易表达, 免疫原性低等特点。这种小型化的基因工程抗体在基础研究、开发新药和疾病的诊断和治疗上具有广阔的应用前景。

【关键词】纳米抗体重链抗体 VHH

抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中, 新型基因工程抗体不断出现, 包括嵌合抗体、人源性抗体等。抗体小型化是抗体基因工程研究的主要研究方向之一, 如一些单价小分子抗体scFv, 但在稳定性、表达产量、蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改进。

1989年, Ward等研制出由重链可变区（VH）组成的抗原结合片段, 命名为单域抗体或dAbs。然而, 其抗原亲合力低,易聚合。1993年, Hamers-Casterman等［1］报道骆驼的功能性抗体都由重链组成, 天然缺失轻链, 即重链抗体（HCAbs）。克隆重链抗体的可变区

得到只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH), 晶体结构直径2.5 nm、长4 nm, 因此称为纳米抗体。在这里我们对其独特的生物物理性质及其应用做一阐述。

1 纳米抗体的结构特征

纳米抗体具有完整的抗原结合片段。骆驼的HCAbs具有独特的重链可变区（VHH）,一个铰链区和两个恒定区（CH2和CH3）。恒定区CH1是与轻链锚定的部位, 在纳米抗体的基因组中存在, 但在mRNA形成中被剪切掉, 所以纳米抗体缺乏轻链［2］。因此, 纳米抗体靠仅有的3个CDRs就具备了特异的抗原结合能力和高亲合力, 而普通抗体则需要6个CDRs。

纳米抗体的晶体和水溶性结构由2个β片层组成支架, 类似普通抗体的VH免疫球蛋白折叠。纳米抗体的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大, CDR3区也更长。人和小鼠VH的CDR3平均长度分别为12和9个氨基酸, 而纳米抗体则为16～18个氨基酸。纳米抗体包含了骨架区（framework region, FR）的氨基酸残基, 因此纳米抗体能补偿抗原结合位点VL的缺乏。普通抗体的FR2中, V37, G44, L45和W47这4个氨基酸残基参与VL的相互作用, 而在纳米抗体中, 这几个氨基酸残基发生了改变, 突变为F37, E44, R45, G47, 由疏水性变为亲水性, 使纳米抗体更易于溶解［3］。利用这一特点, 对人

源抗体VH结构域FR2中的一些氨基酸进行VHH特征性改造, 即在人VH区的44、 45和47位点氨基酸残基用纳米抗体中相对应的代替, 所得到的骆驼化单域VH抗体不仅保持原有抗体的特异性和亲和力, 且溶解性好、稳定性好［4］。基因工程化纳米抗体结构的稳定性和可溶性还与CDR长度和多样性相关的突变有关。

比较人类VH3基因序列与骆驼的VHH胚系基因序列, 发现二者有高度的同源性。另外, 在小鼠B或T细胞缺乏对纳米抗体的免疫应答。因此, 带有人VHFR2烙印的纳米抗体的建立可能是获得非免疫原性纳米抗体的方法。

2 纳米抗体的特性

纳米抗体的单域性质使其较普通抗体具有一些独特的性质。

2.1 容易制造和表达纳米抗体是Mr为15000的单域蛋白。重组纳米抗体通常在E.coli中表达量为10 mg/L。从真菌和酵母中能高水平分泌纳米抗体, 在振荡培养的酵母菌（saccbaromyces cerevisiae）中产量为100 mg/L, 而10 L的补料发酵方法能获得大于1 g/L的产量。从15 m3的发酵中可以获得大于1 kg的纳米抗体［5］。

2.2 纳米抗体的高水溶性和稳定性 VH结构域单独表达时通常形成包涵体, 或者暴露的疏水域相互黏附。由于在纳米抗体中FR2中的疏水残基被亲水残基代替, 纳米抗体水溶性增加, 聚合性减少, 即

使以包涵体形式表达, 纳米抗体也很容易复性。

一些纳米抗体能耐高温且具有高度的构像稳定性。在37℃孵育1周后纳米抗体仍具有80%的结合活性。另外, 它具有可逆的去折叠能力, 将它长期放在高于90℃的环境后仍能重新获得抗原结合能力［6］。纳米抗体的熔点在60～78℃［7］, 而其他的抗体及其片段常会在热变性后不可逆的聚合。纳米抗体还显示出在离液剂［7］、存在蛋白酶和极度pH值下的变性效应下具有高度稳定性。因此, 在苛刻的条件中纳米抗体能保持稳定性, 如胃液和内脏中, 为口服治疗胃肠道疾病提供新的思路。

2.3 纳米抗体识别独特的构造表位纳米抗体比普通抗体有更广泛的抗原结合能力, 从小分子的半抗原和肽, 到大分子的蛋白和病毒。甚至当靶蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别的位点时, 小分子的纳米抗体也可以对其进行表位识别［8］。纳米抗体的CDR3区可以形成一个大的暴露的凸环, 凸环中的二硫键使其结构稳定, 这个长CDR3环能结合蛋白空间构像上的裂隙和空腔 ,参与大部分抗原结合反应。所以, 从纳米抗体中可以容易地找到酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等。普通抗体的抗原结合表面常形成一个凹面或平面, 与抗原作用后会被固定, 在结合能上产生阴性反应（熵效应）。骆驼纳米抗体的长CDRs环大部分折叠在FR2上, 在这里疏水残基受保护,避免与外界水性环境接触。另外, CDR3环包含一个半胱氨酸, 与CDR1（或45位点）形成二硫键。这种二硫键的存在能够稳定CDR3形成的

凸环结构, 从而降低与抗原的结合能［9］。

3 纳米抗体的应用价值

纳米抗体具有独特的性质如Mr小、水溶性好、稳定性强、抗原识别能力强、易于生产等。因此在生物技术和医学应用方面, 比其他抗体具有优越性。

3.1 纳米抗体用于构建多种分子结构双特异性和双功能抗体在免疫诊断和治疗上有许多实用性。双特异性抗体能结合一个靶抗原的相邻的两个位点, 从而获得对抗原的高亲合力。双功能抗体能传递毒性载体, 如放射性核素、细胞毒性药物等到靶抗原, 包括癌细胞。这种多特异性分子的理想性质是: 小分子、高水溶性、高稳定性、缺乏聚合或蛋白水解倾向、高表达产量。以scFv构建的双特异性和双功能抗体, 表达水平低、易聚合和被蛋白水解, 阻碍了大规模的临床发展。

纳米抗体的严格单域本质, 高水溶性和高稳定性, 构造的双功能或二价体蛋白在细菌中能高表达, 完全保留原有的功能。Zhang等［10］将从天然纳米抗体库中筛选的单域纳米抗体五聚化, 极大地提高了与抗原的亲和力。五聚体纳米抗体表现出良好的热力学稳定性以及不易被蛋白酶所降解等特性。

将酶或毒素蛋白的基因与纳米抗体的基因融合可产生一些