细胞生物学检测技术

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二、细胞固定观察法
固定法是以一定的化学物质的溶液（有时是气体）在尽可能保持细 胞生活结构的情况下迅速杀死组织块，这一过程称为固定 （fixation）。然后制成薄片，在染色（staining）进行观察。 这种方法比起观察活细胞有三个优点：第一，它能清楚地显现细 胞的细微构造，如关于染色体，各种细胞器、细胞膜和细胞壁的 微细构造都是靠这种方法阐明的。第二，这种方法的制片一般均 能保存很久，便于前后研究各种现象之比较。第三，应用范围广， 几乎可用于所有的组织细胞。 包括固定和染色2个过程。
应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。
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5、偏光显微镜
是研究具双折射性物质的主要仪器，如纤维、染色体和透明矿物 等。与一般的生物显微镜相比，最主要的区别是有两个偏光镜。 其中，一个安装在载物台之下，称下偏光，另一个安装在载物台 之上的镜筒中，称上偏光。在偏光显微镜中，上偏光的振动方向 是固定的，而下偏光的振动方向是可以调节的。一般来说，两个 偏光的振动方向是相互垂直的。
6、 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 1952年，日本的 Nomarski发明。能显示细胞结构的三维立 体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录 像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。
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尼康E800荧光DIC显微镜
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DIC显微镜下的硅藻
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7、倒置显微镜 inverse microscope

物镜与照明系统颠倒，前 者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培 养的活细胞，通常具有相 差物镜，有的还具有荧光
装置。
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8、当代显微镜的发展趋势
采用组合方式，

集普通光镜加相
差、荧光、暗视 野、 DIC 、摄影装 置于一体。
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一、显微镜直接观察
显微镜是观察细胞形态结构的主要工具，按照光源不同，分为光学 显微镜（可见光/紫外光）和电子显微镜（电子束）。
（一）、光学显微镜
1、相差显微镜（PCM）
1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本 的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了 各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
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荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 12 医学资料
3、 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜）
可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察 较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上 的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可 以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的 测量。
第五章 细胞生 物学检测技术
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内容
掌握各种细胞形态观察法的原理与操作方法
掌握MTT方法的原理与操作方法 熟悉免疫细胞化学检测技术的原理与操作方法
了解放射性掺入法和流式细胞法的原理与应用
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第一节 细胞形态观察技术
自20世纪建立细胞培养技术以来，培养技术和培养基成分不断改 进，已经广泛用于现代生物学研究和生产的各个领域，如形态 研究、医学领域、兽医研究、遗传研究、生物制药等。 利用细胞培养可以在体外研究药物作用机理、有效剂量，对细胞 形态结构、生理机能和代谢的影响。 本章用于以细胞为载体的研究中，通过观察细胞形态和机能变化， 为判断效应分子的作用，提供依据。
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偏光显微镜
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偏光显微镜的构造
镜臂、镜筒、镜座、 反光镜、下偏光镜、 锁光圈、聚光镜、载物台、 物镜、目镜、 上偏光镜、勃氏镜、 粗调螺丝、细调螺丝、 附件等
1、目镜，2、镜筒，3、勃氏镜，4、粗动 手轮，5、微调手轮，6、镜臂，7、镜座， 8、上偏光镜，9、试板孔，10、物镜，11、 载物台，12、聚光镜，13、锁光圈，14、 下偏光镜，15、反光镜 20 医学资料
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一种介壳虫的染色体（PCM照片）
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2、荧光显微镜
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另 有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染 色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进 行定性和定量研究的工具之一。
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第一节 细胞形态观察技术
细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样， 且体型微小，要对细胞进行研究，需借助显微镜的成像及放大原 理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。通过观察形 态可以检测药物对细胞的作用。 细胞可直接观察、染色观察；可用光镜、荧光显微镜法和电镜法等 观察。 常见的观察方法有：
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LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管
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4、 暗视野显微镜
使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允 许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒 子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

应用：观察未经染色的标本和活细胞。
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操作步骤：
1、打开光源 调整相差聚光器的位置和物镜放大倍数。目镜换成 普通望远镜，使视野中2个大小一样的光环重合。
2、观察瓶皿准备 表面搽干净，放入目镜台。
3、调光 调节光强度、光轴，使视野照明均匀。
4、调焦与摄影 使视野图像最清晰，拍照。 观察时以观察目镜为准，照相以摄影目镜为准。
Hale Waihona Puke Baidu
自动化与电子化。
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（二）、活细胞染色方法 染色为便于观察 1、中性红染色
使用0.01%浓度，高压灭菌后暗处保存。
活细胞——红色；死细胞无色。 2、结晶紫染色
使用0.1%浓度，对死活细胞均着色。可用于总细胞计数。
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3、台盼蓝染色法



制备单个细胞悬液：105～106／ml 0.4%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细 胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞 数）］×100