苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究

崔建东，张云峰，李 艳

(河北省发酵工程研究中心，河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018)

摘 要：为了提高重组苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力，研究培养基初始pH 值、种龄、接种量、装液量和发酵时间对重组PAL 活力的影响，并用响应面分析法优化了培养条件。单因素最适培养条件为：发酵培养基初始pH7.0、种龄10h 、接种量10%、装液量50ml 、发酵时间24h 。响应面优化后的结果表明，种龄、接种量和发酵时间对重组PAL 活力影响较大，但三者之间没有显著的交互作用。优化后的产酶条件是：种龄13.3h 、接种量10.7%、发酵时间25.5h 、在此条件下，PAL 活力比不优化的培养条件的酶活增加了15%左右，重组PAL 酶活达到14.95 U/m l 。

关键词：苯丙氨酸解氨酶；重组大肠杆菌；培养条件；响应面分析

Optimization of Production Conditions of Phenylalanine Ammonia-Lyase by Recombinant E.coli

CUI Jian-dong ，ZHANG Yun- feng ，LI Yan

(Hebei Fermentation Engineering Research Center, College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and

Technology, Shijiazhuang 050018, China)

Abstract ：Effects of initial pH value of fermentation medium, inoculation time, inoculation volume, broth volume in 250-ml flask and fermentation time on the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) produced by recombinant E. coli JM109 were investigated through single-factor test, and then the main affecting factors confirmed in single-factor test were optimized through response surface analysis (RSA). The results showed that initial pH value of fermentation medium and broth volume in 250-ml flask are not main affecting factors, and they can be controlled at 6.5 to 7 and 50 ml, respectively; inoculation time, inoculation volume and fermentation time are main affecting factors, and their optimal levels are 13.3 h, 10.7 % and 25.5 h, respectively. By this optimization, the activity of PAL is increased by about 15%, reaching 14.95 U/ml.

Key words ：phenylalanine ammonia-lyase ；recombinant E. coli ；culture conditions ；response surface analysis 中图分类号：Q946.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)07-0181-05

收稿日期：2008-06-09

基金项目：河北科技大学自然科学基金项目(XL200763)

作者简介：崔建东(1974-)，男，讲师，博士，研究方向为生物反应工程。E-mail ：cjdoo7cu@

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase ，PAL ，EC4.3.1.5) 可以抑制某些肿瘤，治疗苯丙酮尿患者，其主要作用是催化反式肉桂酸转化生产L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸是合成新型甜味剂阿斯巴甜的主要原料[1-2]。在大多数高等植物、部分丝状真菌、 酵母和某些链霉菌中都含有PAL [3-4]。但L-苯丙氨酸生产中所用的PAL 酶主要来自红酵母属。在生产过程中，由于红酵母的P A L 产量低，酶活迅速下降，极大的限制了L-苯丙氨酸的生产。为了改善这种情况，一些学者在红酵母培养过程中，利用不同的氨基酸作为诱导物来提高PAL 产量[5-6]。还有一些学者通过改善红酵母细胞通透性来提高PAL 酶活[7-8]。一些学者试图用PAL 重组大肠杆菌高效表达合成PAL [9-10]。虽

然红酵母PAL 在大肠杆菌中得到高效表达，但重组PAL

产量和活力仍然较低，不足以工业化生产。在以前的研究中，尽管已经优化了PAL 重组大肠杆菌产酶培养基[11-12]

，但对重组PAL 大肠杆菌产酶条件的研究基本没有报道。因此，优化P A L 重组大肠杆菌产酶条件，提高重组PAL 活力是急需开展的工作。本研究重点探讨了不同的培养条件对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶的影响，并利用响应面分析法优化了产酶条件，以获得较佳的产酶条件，提高重组P A L 产量和活力。１材料与方法1.1

材料与试剂

重组大肠杆菌JM109 (含有质粒PBV220-PAL、携带PAL基因，Amp抗性)，参考文献[13]方法构建。圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因被克隆进入表达质粒PBV220(中国北京306医院李建欣惠赠)，PAL的表达被启动子Tac和PRPL控制。

蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、氨苄青霉素、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、柠檬酸、乙二胺四乙酸、氯化钴、氯化锰、氯化铜、硼酸、高锰酸钠、乙酸锌、浓盐酸、双(三(羟甲基))氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化胺、L-苯丙氨酸、反式肉桂酸。

1.2仪器与设备

PHS-25 型雷磁数显pH计、752紫外光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司；DSHZ-300型水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备；VS-1300-U超净工作台江苏苏净集团安泰公司；FA2004电子天平上海精科天平有限公司；TDA-8002恒温水浴槽天津中环科技开发公司；YXQG01高压蒸汽灭菌锅山东新华医疗器械厂；YXQG01低速离心机北京医用离心机厂。

1.3培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 1、葡萄糖1、氨苄青霉素0.5，pH7.0；发酵培养基(g/L)：葡萄糖20、磷酸二氢钾13.3、磷酸氢二铵4、硫酸镁1.2、柠檬酸 1.7、氯化锰15 、氯化铜1.5、硼酸3 、高锰酸钠2.5、乙酸锌13、乙二胺四乙酸8.4mg/L、氢化钴2.5mg/L，pH7.0。

1.4方法

1.4.1培养方法

将活化后的菌种1ml转入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min条件下摇瓶培养12h。以10%接种量将种子培养液接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、200 r/min条件下摇瓶培养16h，42℃诱导表达4h后在30℃培养直到测酶活。1.4.2酶活的确定

取10ml重组大肠杆菌培养液4 000r/min离心10min，去离子水冲洗两次后，用10ml 浓度为25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)悬浮菌体沉淀，得到菌悬液。

PAL酶活性的测定：测定方法见文献[14]，一个酶活单位定义为每分钟转化1mmol L-苯丙氨酸成为肉桂酸的所用酶量。PAL比酶活表示为每毫升发酵液含有的活力单位数。

取1ml菌悬液，用0.5g/L的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在30℃处理30min，4000r/min离心10min，用去离子水冲洗两次菌体沉淀，离心，菌体沉淀中加入2.5ml 50mmol/L L-苯丙氨酸溶液、2ml 25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，在30℃保温10min，加入6mol/L HCl 0.2 ml终止反应，4000r/min离心10min，在752分光光度仪上测定上清液的吸光度A278nm。根据反式肉桂酸标准曲线得出生成的反式肉桂酸质量浓度，获得每次反应的酶活。酶活性的计算公式：

C V

U=———

Mw・t

式中：C为反式肉桂酸质量浓度；V为反式肉桂体积；M w为反式肉桂酸分子量；t为反应时间。

1.4.3试验设计

试验以PAL酶活为考核指标，分别对发酵培养基初始p H值、接种时间、接种量、装液量和发酵时间进行单因素试验，在单因素试验的基础上利用响应面方法对PA L产酶条件进行优化。

1.4.3.1单因素试验

发酵培养基初始pH值的选择：分别将发酵培养基的初始p H值调为6、6.5、7、7.2、7.5，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳初始pH值的发酵培养基。

接种时间的选择：分别选择培养种龄在8、10、12、14、16h的种子接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳接种时间。

接种量的选择：以培养10h的种子按5、8、10、12、15%(种子液:发酵培养基，V/V)的接种量接种，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测P A L酶活，获得最佳接种量。

装液量的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%接种初始pH值为6.8的发酵培养基(发酵培养基在三角瓶中装液量分别为25、50、75、100、125m l)，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳装液量。

发酵时间的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，在三角瓶中装液量为50ml。发酵时间分别为20、22、24、26、28h后检测P A L酶活，获得最佳发酵时间。

1.4.3.2响应面实验优化PAL产酶条件

根据单因素试验结果，选择因素中有意义的水平进行响应面分析实验，对结果进行分析，并获得最佳的P A L产酶条件。利用R S M软件，以接种量、种龄和发酵时间为因素，选择三个水平进行实验。

２结果与分析

2.1初始pH值对PAL酶活性的影响

由图1可知，当初始pH值在6.5～7之间时，重组