苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究
崔建东，张云峰，李 艳
(河北省发酵工程研究中心，河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018)
摘 要：为了提高重组苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力，研究培养基初始pH 值、种龄、接种量、装液量和发酵时间对重组PAL 活力的影响，并用响应面分析法优化了培养条件。

单因素最适培养条件为：发酵培养基初始pH7.0、种龄10h 、接种量10%、装液量50ml 、发酵时间24h 。

响应面优化后的结果表明，种龄、接种量和发酵时间对重组PAL 活力影响较大，但三者之间没有显著的交互作用。

优化后的产酶条件是：种龄13.3h 、接种量10.7%、发酵时间25.5h 、在此条件下，PAL 活力比不优化的培养条件的酶活增加了15%左右，重组PAL 酶活达到14.95 U/m l 。

关键词：苯丙氨酸解氨酶；重组大肠杆菌；培养条件；响应面分析
Optimization of Production Conditions of Phenylalanine Ammonia-Lyase by Recombinant E.coli
CUI Jian-dong ，ZHANG Yun- feng ，LI Yan
(Hebei Fermentation Engineering Research Center, College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and
Technology, Shijiazhuang 050018, China)
Abstract ：Effects of initial pH value of fermentation medium, inoculation time, inoculation volume, broth volume in 250-ml flask and fermentation time on the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) produced by recombinant E. coli JM109 were investigated through single-factor test, and then the main affecting factors confirmed in single-factor test were optimized through response surface analysis (RSA). The results showed that initial pH value of fermentation medium and broth volume in 250-ml flask are not main affecting factors, and they can be controlled at 6.5 to 7 and 50 ml, respectively; inoculation time, inoculation volume and fermentation time are main affecting factors, and their optimal levels are 13.3 h, 10.7 % and 25.5 h, respectively. By this optimization, the activity of PAL is increased by about 15%, reaching 14.95 U/ml.
Key words ：phenylalanine ammonia-lyase ；recombinant E. coli ；culture conditions ；response surface analysis 中图分类号：Q946.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)07-0181-05
收稿日期：2008-06-09
基金项目：河北科技大学自然科学基金项目(XL200763)
作者简介：崔建东(1974-)，男，讲师，博士，研究方向为生物反应工程。

E-mail ：cjdoo7cu@
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase ，PAL ，EC4.3.1.5) 可以抑制某些肿瘤，治疗苯丙酮尿患者，其主要作用是催化反式肉桂酸转化生产L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸是合成新型甜味剂阿斯巴甜的主要原料[1-2]。

在大多数高等植物、部分丝状真菌、 酵母和某些链霉菌中都含有PAL [3-4]。

但L-苯丙氨酸生产中所用的PAL 酶主要来自红酵母属。

在生产过程中，由于红酵母的P A L 产量低，酶活迅速下降，极大的限制了L-苯丙氨酸的生产。

为了改善这种情况，一些学者在红酵母培养过程中，利用不同的氨基酸作为诱导物来提高PAL 产量[5-6]。

还有一些学者通过改善红酵母细胞通透性来提高PAL 酶活[7-8]。

一些学者试图用PAL 重组大肠杆菌高效表达合成PAL [9-10]。

虽
然红酵母PAL 在大肠杆菌中得到高效表达，但重组PAL
产量和活力仍然较低，不足以工业化生产。

在以前的研究中，尽管已经优化了PAL 重组大肠杆菌产酶培养基[11-12]
，但对重组PAL 大肠杆菌产酶条件的研究基本没有报道。

因此，优化P A L 重组大肠杆菌产酶条件，提高重组PAL 活力是急需开展的工作。

本研究重点探讨了不同的培养条件对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶的影响，并利用响应面分析法优化了产酶条件，以获得较佳的产酶条件，提高重组P A L 产量和活力。

１材料与方法1.1
材料与试剂
重组大肠杆菌JM109 (含有质粒PBV220-PAL、携带PAL基因，Amp抗性)，参考文献[13]方法构建。

圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因被克隆进入表达质粒PBV220(中国北京306医院李建欣惠赠)，PAL的表达被启动子Tac和PRPL控制。

蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、氨苄青霉素、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、柠檬酸、乙二胺四乙酸、氯化钴、氯化锰、氯化铜、硼酸、高锰酸钠、乙酸锌、浓盐酸、双(三(羟甲基))氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化胺、L-苯丙氨酸、反式肉桂酸。

1.2仪器与设备
PHS-25 型雷磁数显pH计、752紫外光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司；DSHZ-300型水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备；VS-1300-U超净工作台江苏苏净集团安泰公司；FA2004电子天平上海精科天平有限公司；TDA-8002恒温水浴槽天津中环科技开发公司；YXQG01高压蒸汽灭菌锅山东新华医疗器械厂；YXQG01低速离心机北京医用离心机厂。

1.3培养基
种子培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 1、葡萄糖1、氨苄青霉素0.5，pH7.0；发酵培养基(g/L)：葡萄糖20、磷酸二氢钾13.3、磷酸氢二铵4、硫酸镁1.2、柠檬酸 1.7、氯化锰15 、氯化铜1.5、硼酸3 、高锰酸钠2.5、乙酸锌13、乙二胺四乙酸8.4mg/L、氢化钴2.5mg/L，pH7.0。

1.4方法
1.4.1培养方法
将活化后的菌种1ml转入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min条件下摇瓶培养12h。

以10%接种量将种子培养液接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、200 r/min条件下摇瓶培养16h，42℃诱导表达4h后在30℃培养直到测酶活。

1.4.2酶活的确定
取10ml重组大肠杆菌培养液4 000r/min离心10min，去离子水冲洗两次后，用10ml 浓度为25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)悬浮菌体沉淀，得到菌悬液。

PAL酶活性的测定：测定方法见文献[14]，一个酶活单位定义为每分钟转化1mmol L-苯丙氨酸成为肉桂酸的所用酶量。

PAL比酶活表示为每毫升发酵液含有的活力单位数。

取1ml菌悬液，用0.5g/L的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在30℃处理30min，4000r/min离心10min，用去离子水冲洗两次菌体沉淀，离心，菌体沉淀中加入2.5ml 50mmol/L L-苯丙氨酸溶液、2ml 25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，在30℃保温10min，加入6mol/L HCl 0.2 ml终止反应，4000r/min离心10min，在752分光光度仪上测定上清液的吸光度A278nm。

根据反式肉桂酸标准曲线得出生成的反式肉桂酸质量浓度，获得每次反应的酶活。

酶活性的计算公式：
C V
U=———
Mw・t
式中：C为反式肉桂酸质量浓度；V为反式肉桂体积；M w为反式肉桂酸分子量；t为反应时间。

1.4.3试验设计
试验以PAL酶活为考核指标，分别对发酵培养基初始p H值、接种时间、接种量、装液量和发酵时间进行单因素试验，在单因素试验的基础上利用响应面方法对PA L产酶条件进行优化。

1.4.3.1单因素试验
发酵培养基初始pH值的选择：分别将发酵培养基的初始p H值调为6、6.5、7、7.2、7.5，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳初始pH值的发酵培养基。

接种时间的选择：分别选择培养种龄在8、10、12、14、16h的种子接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳接种时间。

接种量的选择：以培养10h的种子按5、8、10、12、15%(种子液:发酵培养基，V/V)的接种量接种，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测P A L酶活，获得最佳接种量。

装液量的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%接种初始pH值为6.8的发酵培养基(发酵培养基在三角瓶中装液量分别为25、50、75、100、125m l)，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳装液量。

发酵时间的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，在三角瓶中装液量为50ml。

发酵时间分别为20、22、24、26、28h后检测P A L酶活，获得最佳发酵时间。

1.4.3.2响应面实验优化PAL产酶条件
根据单因素试验结果，选择因素中有意义的水平进行响应面分析实验，对结果进行分析，并获得最佳的P A L产酶条件。

利用R S M软件，以接种量、种龄和发酵时间为因素，选择三个水平进行实验。

２结果与分析
2.1初始pH值对PAL酶活性的影响
由图1可知，当初始pH值在6.5～7之间时，重组
PAL 的酶活力较高，低于或高于这个范围酶活都受到抑制。

表明过高的pH 值不但抑制了重组菌的生长，同时对重组菌产酶也会有抑制作用。

而过低的pH 值可能会使菌体量过低，菌体过早衰亡，导致产酶减少，酶活降低。

2.2
种龄(接种时间)对PAL 酶活性的影响
由图2可知，培养10h 的种子发酵培养后重组PAL 活力最高，随着种龄增大，重组P A L 活力反而下降。

表明过于年轻的种子生长不够旺盛，生长慢，产酶时间延迟。

而过于老龄化的种子活力不高，代谢副产物积累影响产酶。

2.3
接种量对PAL 酶活性的影响
重组PAL 活力最大。

当接种量超过10%时，重组PAL 活力反而下降。

接种量过大，菌体生长过快，菌体过早衰亡，产酶不高。

接种量过低，菌体生长缓慢，发酵周期长，产酶时间延缓。

2.4
装液量对PAL 酶活性的影响
由图4可知，当装液量为50ml 时，重组PAL 活力
最大。

随着装液量超过75ml 后，重组PAL 活力反而下降。

装液量过大，溶液中溶解氧不足，导致菌体生长受阻，产酶降低。

装液量过低，培养基中营养物质消耗过快，菌体生长也会受阻，产酶受到影响。

2.5
发酵时间对PAL 酶活性的影响
由图5可知，发酵时间24h 时，重组PAL 活力最高，超过24h ，活力迅速下降。

2.6
响应面法优化重组PAL 产酶条件
SAS 软件中响应面分析的方法被广泛应用在考察影响因素、因素间的相互关系以及确定最优的因素影响浓度和组合[15-17]。

上述实验表明，接种量、种龄和发酵时间对重组PAL 活力影响较大，为了进一步考察这三个
因素组合对重组P A L 活力影响，在单因素试验的基础上，利用SAS 软件中响应面分析的方法对这三个因素组合进行了优化。

2.6.1
因素与水平的选取
根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理[18]，采用三因素三水平的响应面分析方法(RSA)优化接种量、种
图１ 初始ｐＨ值对重组ＰＡＬ酶活性的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ＰＡＬ
ａｃｔｉｖｉｔｙ
2015
1050酶活(U /m l )
pH
5
5.5
6
6.57
7.5
8
图２ 接种时间对重组　ＰＡＬ酶活性的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ＰＡＬ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
14121086420
接种时间(h)
6810
12141618
酶活(U /m l )
图３ 接种量对ＰＡＬ酶活性的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｎ　ＰＡＬ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
1614121086420
接种量(%)
46810121416
酶活(U /m l )
图４ 装液量对ＰＡＬ酶活性的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂｒｏｔｈ　ｖｏｌｕｍｅ　ｉｎ　２５０ｍｌ　ｆｌａｓｋ　ｏｎ　ＰＡＬ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
181614121086420
装液量(ml)
02040
6080100120140
酶活(U /m l )
图５ 发酵时间对ＰＡＬ酶活性的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ＰＡＬ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
1614121086420
酶活(U /m l )
发酵时间(h)
18202224262830
由图3可知，在接种量5%～10%时，随着接种量增大，重组P A L 活力逐渐增加，当接种量为10%时，
龄和发酵时间的最佳组合。

试验因素和水平设计见表1。

水平因子
X 1种龄(h)
X 2接种量(%)
X 3发酵时间(h)
－11082201210241
14
12
26
表１ 中心组合试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ　１ Ｔｈｒｅｅ　ｍａｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
试验号X 1X 2X 3酶活(U/ml)1－1－1012.65
2－11013.0531－1013.56411012.8350－1－113.2060－1110.23701－112.96801112.239－10－111.501010－112.4411－10112.721210114.291300014.841400015.0815
14.78
表２ 中心组合试验设计及响应值表
Ｔａｂｌｅ　２ Ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｖａｌｕｅ2.4.2试验设计与结果
对接种量、种龄和发酵时间作变换因素水平，变
换为以下公式：X 1=(种龄－12)/2，X 2=(接种量－10)/2，X 3=(发酵时间－24)/2。

以三次试验所得重组PAL 比酶活的平均值为响应值，试验设计与试验结果见表2、3。

响应面分析见图3。

方差来源
自由度平方和均方F 值Pr>F 显著性
X 11 1.2561 1.25610.92670.3799X 210.25560.25560.18860.6822X 310.04520.04520.03320.8625X
1
1 1.5660 1.5660 1.15540.3315X 1X 210.31920.31920.23550.6479X 1X 310.10890.10890.08030.7882X 2
1 5.5521 5.5521 4.09630.0988*X 2X 3
1 1.2544 1.25440.92550.3802X
3
18.51678.5167 6.28360.054*
回归917.1011 1.9001 1.4019
0.371
参差5 6.7769 1.3553
总离差
14
23.8779
表３ 参数估计及方差分析表
Ｔａｂｌｅ　３ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｅｓｔｉｍａｔｅｓ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｏｆ
ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｄａｔｅ　ｉｎ　Ｔａｂｌｅ　２
注：*.差异显著，p ＜0.05。

222对重组PAL 活力影响较大的是接种量和发酵时间，但在种龄、接种量和发酵时间三者之间对重组PAL 活力没有交互叠加作用。

采用SAS 软件中的RSREG 程序对响应值与各因素进行回归拟合，得到以下回归方程：Y=14.9+0.39625X 1+0.17875X 2－0.075X 3－0.65125X 1
－0.2825X 1X 2+0.165X 1X 3－
1.22625X 2+0.56X 2X 3－1.51875X 3
表3表明，用 F 检验判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，概率P r 越小，则相应变量的显著程
度越高。

回归分析结果表明，回归方程是高度显著的，相关系数R=91.52 %，说明响应值(重组PAL 比酶活稳定性)的变化有91.52 %来源于所选变量，回归方程能较好的描述各因素与响应值之间的真实关系。

二次方项X 2
2
和X 32是显著的，但三个单因素(种龄、接种量和发酵时间)之间的交互项(X 1X 3，X 1X 2和X 2X 3)是不显著的。

2
2
214.51413.51312.5
酶活(U /m l
)
－0.9－0.30.9
0.3种龄
0.9
0.3
－0.3－0.9
a 14.51413.51312.5
酶活(U /m l
)
种龄
－0.9
－0.30.9
0.3
c
0.90.6
0.30－0.3－0.6－0.9
接种量
种龄－0.9－0.6－0.30
0.30.60.9
13.514
14.5
酶活(U/ml)
1312.5
b
10%接种量接种，重组PAL 活力最大；装液量为50ml ，发酵时间在24h 时，重组P A L 表现出较高的活力。

3.2响应面优化的结果表明：对重组PAL 活力影响较大的因素是种龄、接种量和发酵时间，但三者之间没有显著的交互作用。

优化后的产酶条件是：种龄13.3h 、接种量10.7%、发酵时间25.5h ，在此条件下，PAL 活力比不优化的培养条件的酶活增加了15%左右，重组PAL 酶活达到14.95 U/ml 。

参考文献：
[1]JEN R, FLORIAN K, NIKOLAUS A. Maize phenylalanine ammonia lyase has tyrosine ammonia-lyase activity[J]. Plant Physiol, 1997, 113: 175-179.[2]
SIKORA L A, MARZLUFF G A. Regulation of L-phenylalanine ammo-nia lyase by L- phenylalanine and nitrogen in Neurosporo crassa [J].Journal of Bacteriology, 1982, 150:1287-1292.
[3]
HARRY J G, IAN N C, RAYMOND K G. Molecular cloning of the phenylalanine ammonia lyase gene from Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12[J]. Journal of Bacteriology, 1985, 161: 314-320.[4]JAMES F K, MICHAEL J F. Regulation of phenylalanine ammonia lyase in Rhodotorula glutinis [J]. Journal of Bacteriology, 1985, 161(3): 963-966.[5]
MARUSICH W C, JENSEN A R. Induction of L-phenylalanine ammo-nia lyase during utilization of phenylalanine as a carbon source or nitro-gen source in Rhodotorula glutinis [J]. Journal of Bacteriology, 1981,146: 1013-1019.
[6]
NAKAMICHI K K, NABE S Y, CHIBATA I. Induction and stabiliza-tion of L-phenylalanine ammonia lyase activity in Rhodotorula glutinis [J]. Eur J Appl Microbiol Bio-technol, 1983, 18: 158-162.
[7]GODWIN B D C. Enrichment of phenylalanine ammonia lyase activity of Rhosotorula yeast [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 36: 498-502.[8]
SRINIYASAN A R, NAGAJYOTHI Y, GOWDA L R. Phenylalanine ammonia lyase activity enhancement in permeabilized yeast cells (Rhodotorula glutinis )[J]. Biotechnol Techs, 1994, 8: 729-732.
[9]
JAMES D B, FAULKNERA T, MICK F T. High-level expression of the phenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloides in Sacchpromyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctional expression system[J]. Gene, 1994, 143: 13-20.
[10]
MATHIAS B, GEORG E S. Overexpression of a designed 2.2 kb gene of eukaryotic phenylalanine ammonia-lyase in Escherichia coli [J]. FEBS Letters, 1999, 457: 57-60.
[11]崔建东, 谭之磊, 李飞. 苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养[J]. 现代食品科技, 2007, 23(9): 32-34.
[12]崔建东, 贾士儒. pH 对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌生长及产物表达的影响[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(12): 26-29.
[13]
FUKUHARA N, YOSHINA J. Recombinant plasmid for the expression of L-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying , 4946790[P]. 1993: 04-28.
[14]杨顺楷, 李果龙, 赵健身. 酵母全细胞苯丙氨酸鲜氨酶(PAL)活性的紫外分光光度测定法)[J]. 天然产物研究与开发, 1990(1): 59-62.[15]
BANDARU V V R, SOMALANKA S R, MENDUC D R. Optimiza-tion of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch by co-immobilized amyloglucosidase and cells of Zymomonas mobilis using response surface methodology[J]. Enzyme Microb Technol,2006, 38: 209-214.
[16]
CHEISON S C, WANG Z, XU S Y. Use of response surface methodology to optimise the hydrolysis of whey protein isolate in a tangential flow filter membrane reactor[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 80, 1134-1145.[17]
LIU G C, WANG X L, Optimization of critical medium components using response surface methodology for biomass and extracellular polysac-charide production by Agaricus blazei [J]. Appl Microbiol Biotechnol,2007, 74: 78-83.
[18]
BOX G E P, HUNTER W G. Statistics for experiments: an introduction to design, data analysis and model building[M]. New York: Wiley Press, 1990: 156-157.
图３ 种龄、接种量和发酵时间对重组ＰＡＬ活力影响的响应面和等高
线图
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌｏｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｏｕｒ　ｐｌｏｔｓ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　ａｎｙ　ｔｗｏ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｍａｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ＰＡＬ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
由图3(b 、d 和f)的近似圆形的等高线图可知，种龄、接种量和发酵时间之间对重组PAL 活力没有交互作用(越接近圆形交互作用越不显著)。

图3(a 、c 和e)表明，每个响应面都有一个最高点，即每个影响因子对于重组P A L 酶活都有一个最佳稳定条件，因此，可以在实验范围内寻找最优点。

得到X 1=0.65，X 2=0.34，X 3=0.76，将这三个值代入变换式，实验得到最佳稳定剂组合为：种龄为13.3h 、接种量为10.7%、发酵时间为25.5h 。

2.4.3
验证实验
在上述响应面分析求得的最佳组合下重复三次实验，实验值与回归方程预测值吻合的较好。

结果如下：预测值：将X 1=0.65、X 2=0.34、X 3=0.76代入回归方程得到PAL 比酶活为15.03U/ml ；实验值：在种龄13.3h 、接种量10.7%、发酵时间25.5h 条件下重复三次实验，得到酶活的平均值为14.95 U/ml(误差5.3%)。

３结 论
3.1
单因素培养条件对重组PAL 活力的研究表明：当
发酵培养基初始pH 在6.5～7之间，重组PAL 的酶活力较高；培养10h 的种子液是接种发酵较好的种子；以
0.90.60.30－0.3－0.6－0.9
发酵时间
种龄－0.9－0.6－0.300.30.60.9
12.5
1313.514
酶活(U/ml)
14.8
d
14.413.813.212.811.811.6
酶活(U /m l )
发酵时间
接种
量0.9
e 0.90.60.30－0.3－0.6－0.9
酶活(U/ml)
发酵时间
接种量－0.9－0.6－0.300.30.60.9
1212.613.2
14.4
13.8
f。