苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究
苯丙氨酸解氨酶_PAL_的研究进展_崔建东
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
综 述
苯丙氨酸解氨酶 (PAL)的研究进展
崔建东 , 李 艳 , 牟德华 (河北科技大学生物科学与工程学院 , 河北石家庄 050018)
苯丙氨酸解 氨酶 (Phenylalanineammonialyase, PAL, EC.4.3.1.5)广泛存在于各种植物和少数微生物 中 , 是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶 , 在微生 物中可催化 L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨 。 纯化 后的 PAL可以用于治疗某些肿瘤 [ 1] , 监控苯丙酮尿 患者血浆中的苯丙氨酸含量 , 治疗苯丙酮尿患者[ 2] , 但其主要用途是催化反式肉桂酸转化合成 L-苯丙氨 酸 (L-phenylalanine, L-phe)。 L-phe是合成阿斯巴 甜 (aspartame, APM)的主要原料 , 随着 APM的全球 热销和反式肉桂酸生产成本的降低 , 利用 PAL转化 反式肉桂酸合成 L-phe的方法成为当前生物化工领 域研究的热点 。本文就 PAL的基本特点及近几年的 研究进展作简要介绍 , 重点介绍微生物 PAL的研究 进展 。
3 微生物 PAL研究
1966年 , Ogata等 [ 9] 在研究芳香族氨基酸的微生 物代谢时发现 , 红酵母属中的某些种能以 L-苯丙氨 酸为唯一碳 、氮源生长 , 并在培养基中积累肉桂酸 。 随后 , 该酶相继在其它微生物中被发现 , 主要有霉菌 与酵母菌 。包括[ 10] :链霉菌属 (Streptomyces)、枝孢霉 属 (Cladosporium)、粘 滑 菇 属 (Hebeloma)、鳞 伞 属 (Pholiola)、 鬼 伞 属 (Coprinus)、 共 头 霉 (Symcephalasilrum)、烟熏离褶伞属 (Lyophyllum)、内 孢霉 属 (Endomuces)、曲 霉属 (Asperhilllus)、地霉 属 (Geotricum)、 从 梗 孢 属 (Monilella)、 小 丛 壳 属 (Glomerella)、卵 孢酵母 属 (Oosporidium)、类酵 母属 (Saccharomycodes)、掷酵母属 (Sporidiobolus)。 目前 , 对微生物 PAL的研究主要集中在菌种选育以及提高 PAL活性和稳定性方面 。
乙酸对重组大肠杆菌BL21产酶的影响及作用机理研究
乙酸对重组大肠杆菌BL21产酶的影响及作用机理研究戴琨;王腾飞;郝昭程;汤丹丹;刘红娟;王瑞明【摘要】旨在研究发酵过程中产生的乙酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET15b-TreS的生长以及重组海藻糖合酶基因表达的影响,并对其作用机理进行探讨.通过外源添加乙酸(钠)的方法,研究了乙酸钠对重组菌BL21(DE3)/pET15b-TreS生长曲线的影响;利用环境扫描电子显微镜,观察了重组菌形态的变化情况;通过测定菌液的电导率值变化、菌液上清中OD260的变化,研究了乙酸(钠)对菌体细胞膜渗透性、完整性的影响;通过测定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜的影响;利用荧光分析法检测了乙酸对菌体膜蛋白构象的影响;采用SDS-PAGE电泳研究了乙酸钠对菌体重组海藻糖合酶表达量的影响.结果表明,乙酸(钠)会对重组菌的生长产生一定的抑制作用,可以导致菌体细胞的表面出现凹陷、皱缩;并会影响细胞膜的渗透性、完整性,使得一些细胞内容物发生泄漏;影响细胞膜上的膜蛋白构象,对膜的结构造成一定程度的破坏;对重组海藻糖合酶的表达产生影响.乙酸(钠)对重组菌菌体的生长及重组海藻糖合酶基因的表达有影响,并且菌体细胞膜是其作用的一个靶点.%Our objective is to study the effects of acetic acid from fermentation on the growth of the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3)/pET15b-TreS as well as the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the action mechanism was also discussed. Firstly, we studied the effect of acetic acid on the growth of recombinant Escherichia coli by experiments with adding acetic acid(sodium acetate), and observed the morphological changes of recombinant bacteria by using environmental scanning electron microscope. Then, the effects of acetic acid(sodium acetate) on the permeability and the integrity of cellmembrane were studied through the determination of electrical conductivity of the broth and the changes of OD260 of the supernatant. The activity of β-galactosidase in the supernatant was measured to determine the effect of sodium acetate on intracellular membrane, and then the influence of acetic acid on the conformation of membrane protein by using fluorescence analysis were detected. Finally, the effect of sodium acetate on the expression of the recombinant trehalose synthase gene by SDS-PAGE was studied. Results showed that the aceticacid(sodium acetate) could have certain inhibition effects on the recombinant bacteria growth, and caused cell surface to be depressed and shrinkage. The permeability and integrity of cell membranes were affected by the acetic acid(sodium acetate), leading some substances in cells to leak out. And experiments also revealed that the acetic acid could make effects on the conformation of the membrane protein in the cell membrane, which caused a certain degree of damages to the membrane structure. SDS-PAGE analysis suggested that the sodium acetate had impacts on the expression of the recombinant trehalose synthase gene. The acetic acid (sodium acetate) was confirmed to affect the cell growth and the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the cell membrane was a target of its function.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】8页(P206-213)【关键词】乙酸;重组大肠杆菌;抑菌机理;细胞膜;海藻糖合酶【作者】戴琨;王腾飞;郝昭程;汤丹丹;刘红娟;王瑞明【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353;齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353;齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353;齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353;齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353;齐鲁工业大学生物工程学院,济南 250353【正文语种】中文目前，随着重组DNA技术与发酵培养技术的迅速发展，利用基因工程菌获得所需产品的技术日趋成熟。
拟南芥苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的研究进展
拟南芥苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的研究进展孙海燕;全雪丽;付爽;吴松权【摘要】苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷代谢途径第1步反应的限速酶,广泛地参与植物生长发育过程中的各种生理活动.本文概述了拟南芥PAL基因的分子生物学和生理学研究进展,主要包括PAL基因的结构、表达特性、调控机制及其参与的植物生理学的意义,为进一步阐明PAL基因的功能提供参考依据.【期刊名称】《延边大学农学学报》【年(卷),期】2016(038)001【总页数】5页(P88-92)【关键词】拟南芥;苯丙氨酸解氨酶;表达;生理作用【作者】孙海燕;全雪丽;付爽;吴松权【作者单位】延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002【正文语种】中文【中图分类】Q943苯丙烷代谢途径是陆生植物生长和发育所必需的，是植物长期适应自然环境的结果[1-2]。
苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1 5, PAL)催化L-苯丙氨酸(L-Phe)的非氧化脱氨基作用，生成肉桂酸，是生物合成苯丙烷类天然产物的第1步[3-4]，也是第1个被鉴定的植物“防御基因”[5]。
也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶[6]。
肉桂酸是植物生长、发育和环境适应所必需的各种苯丙烷类物质的合成起始物[7]。
苯丙烷类化合物是植物中大量酚类化合物的前体，包括木质素、黄酮类、异黄酮类、香豆素、芪类和水杨酸等，它们在维持植物结构、抵御紫外线、形成花青素和植保素、保持花粉活力、信号转导与交流等方面发挥着重要作用 [1,5,8]。
自1961年Koukol和Conn首次描述PAL以来，苯丙氨酸解氨酶得到了广泛的研究[9]，它是控制苯丙烷途径生物合成去向的关键酶和限速酶[7,10]。
拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，该植物具有个体小、生长周期快、形态特征简单、生命力强、基因组小、遗传操作简单等优点[11-12]。
植物苯丙氨酸解氨酶研究进展
植物苯丙氨酸解氨酶研究进展摘要苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，pal，e.c4.3.1.5)是催化苯丙烷代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶，对植物具有非常重要的生理意义。
综述了苯丙氨酸解氨酶的存在与分布、基本特性、生理代谢意义、抗病以及基因表达与调控等，为pal在植物抗病的应用上提供基础数据。
关键词苯丙氨酸解氨酶；生理作用；抗逆境；基因表达与调控中图分类号s661.1文献标识码a文章编号1007-5739(2009)01-0030-04苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，pal，e.c4.3.1.5)催化l-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。
莽草酸途径产生的莽草酸通过分枝酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些中间产物可进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成coa酯，再进一步转化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产物[1，2]。
一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。
在生物次生物质代谢中具有防紫外线伤害、抵抗病原体的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多种重要作用。
该酶在不同组织中、不同的内外因素调节下，含量水平及其基因表达的时空方式均有所不同。
1pal的存在和分布1961年koukal和conn首次在绿色植物大麦幼苗中发现了pal，并进行了分离纯化[3]。
随着研究的深入，该酶已被固定化，用于工业化生产苯丙氨酸。
至今，pal已在所有绿色植物中发现，在真菌、细菌、藻类中也有存在。
不同植物中pal活性不同，在同一株植物的不同组织部位，pal活性也不同。
一般越嫩的部位pal活性越高，如杨树的幼叶、顶芽、幼茎中pal活性最高，而老茎和成熟叶中pal则较低[4]。
苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程
苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程
1．目的
规范苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程。
2．原理
某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与三氯化铁作用形成绿色化合物。
3．试剂
3.1 苯丙氨酸琼脂成分
DL-苯丙氨酸2g 氯化钠5g
酵母浸膏3g 磷酸氢二钠1g
琼脂12g 蒸馏水1000ml
PH 7.3
3.2 制备除琼脂外其他的成分加热溶解，调PH至7.3，再加入琼脂溶解后分装，每管约4ml,置120℃灭菌15分钟，置成斜面，凝固后冰箱保存，备用。
4．质控
大肠埃希菌ACTT 25922为黄色，阴性；普通变形杆菌CMCC49001为绿色，阳性。
5.操作步骤
将待检菌接种至苯丙氨酸琼脂斜面，35℃孵育18～24小时，在生长的菌苔上滴加三氯化铁试剂，即刻观察结果。
6.结果判断
斜面呈绿色者为阳性。
7.注意事项
7.1 注意接种菌量要多，否则出现假阴性反应。
7.2 苯丙氨酸脱氨酶试验需在加入三氯化铁试剂后，立即观察，因为绿色易很快褪去，不管阳性或阴性结果，都必须在5分钟内作出判断。
8.临床意义
本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性，肠杆菌科其他细菌则为阴性。
苯丙氨酸的生产工艺研究
河北科技大学硕士学位论文苯丙氨酸的生产工艺研究姓名：张朝晖申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：刘守信20100501摘要摘要目前，国内外苯丙氨酸的生产方法主要有生物法和化学法。
其中生物法的缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格并且这种方法只适合于合成天然的L-苯丙氨酸。
化学法则存在污染严重，路线长，拆分困难等问题。
D-苯丙氨酸的生产主要是作为制备L-苯丙氨酸的副产物，目前也有报道发酵法生产D-苯丙氨酸的文章出现，但未见规模生产。
鉴于此，我们根据多年的研究提出了一条新的苯丙氨酸生产工艺路线，首先以丙二酸二乙酯和氯化苄为原料，在碱性条件下合成苄基丙二酸二乙酯，再以亚硝酸酯为肟化剂，乙醇钠为碱，对苄基丙二酸二乙酯进行肟化，得到α-苯丙酮肟酸酯。
最后对α-苯丙酮肟酸乙酯进行了还原，得到DL-苯丙氨酸或其衍生物。
产品再经生物拆分即可得到单一构型的苯丙氨酸。
在第一步反应中，我们用超细微复合碳酸盐代替传统的醇钠，进行反应，从而解决了传统方法易生成二取代物及对设备腐蚀严重的问题，并且工艺过程大为简单，收率可达83%以上。
在第二步反应中，肟化和羧酯的脱去一步完成，减少了反应步骤，提高了收率，此外我们通过工艺研究，解决了亚硝酸酯难易工业化的问题，得到了较好的工艺条件，反应温度为0℃，反应时间为9小时，在20升的放大实验中，收率稳定在90%以上。
在最后的还原步骤中，我们首次采用非晶态镍作为催化剂，硼氢化钠为还原剂，催化还原了碳氮双键，得到了混旋的苯丙氨酸，收率在85%以上，并对非晶态镍的催化机理进行了初步的研究。
另外，我们研究了锌/醋酸体系和催化加氢对α-苯丙酮肟酸乙酯的还原方法，收率均可达90%以上。
关键词苯丙氨酸；肟化；硼氢化钠；非晶态镍；催化加氢I河北科技大学硕士学位论文AbstractAt present, there are two major methods to produce L-phenylalanine, one is the biotransformation and the other is chemical method. The former has some disadvantages, such as a lower concentration of the fermentation product, a long time in a cycle-period of product, and more strict requirements for process control; what’s more, this method is only suitable for the sysnthsis of natural L-phenylalanine. As for the chemical method, its disadvantages including serious pollutions, long route and tedious procedure of chemical resolution.The D-phenylalanine is mainly as a by-product of producing L-phenylalanine. Although there are some reports about producing D-phenylalanine by fermentation method, it is no large scale.Here, a new procedure to produce Phenylalanine was developed in large scale. First, diethyl malonate and benzyl chloride as starting materials were used to produce diethyl benzyl malonate under basic condition. Then it reacted with ethyl nitrited to give α-benzene pyruvic acid oximide ethyl in the presence of sodium ethylate. At last, the production above was reduced to give DL-phenylalanine or derivatives of DL-phenylalanine. The optical purity compound L- and D-phenylalanein is obtained by biocatalysts resolution.In the first step, superfine compound carbonate was instead of sodium ethoxide which was used in traditional method. By this way, the problems caused by sodium ethoxide could be solved, such as di-replacement, serious corrosion to the apparatus and danger. More important , a far more simple procedure was got,meanwhile the yield was over 83%. In the second step, the oximation and the leaving of carboxylester were completed in one step that, shorted the procedures and improved yields. In addition, a large scale produced was realized and a better condition was got by optimized the reaction conditions,that the reaction tempreture was 0℃, reacted for 9 hours. The yields were up to 90% in a 20L reactor. At last, the oximes above was reduced by NaBH4/amorphous Ni to give DL-phenylalanine, yield up to 85% and studied the catalysis mechanism of amorphous Ni. What’ more, ethyl N-acetyl-3- phenylalanine（ethyl phenylalanine）was got by reducing α-benzene pyruvic acid oximide ethyl reduced with Zn/acetic acid system or catalytic hydrogenation, and the yields were up to 90%.Key Words phenylalanine；oxime；sodium borohydride；amorphous nickel；catalytic hydrogenationII第1章绪论第1章绪论1.1 引言氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。
pH对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌生长及产酶的影响
苯 丙 氨 酸解 氨 酶 （ ｈｎ ｌ ａｉｅ ｍ ｏｉ ｌａｅ Ｐ ｅｙ ｌ ｎ ｍ ｎ ｓ， ａｎ Ａ ａｙ Ｐ Ｌ Ｅ ４３１ ） Ａ ， Ｃ ． ． 可以催化反式 肉桂酸转化生产 Ｌ 苯丙 ．５ 一
大肠杆菌 的生长 以及产物 的表达有很大影响 ，不 同重 组 大肠杆菌 的最佳生长与产物表达 ｐ Ｈ不同。邹祥等［ ５ １
到 Ｏ ￣＝ ９ 总 酶 活为 １３ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ／， 别 比不 控 制 ｐ 高 出 ２ Ｄ ｏ１， ２ Ｕ ｇ分 Ｈ ９％和 ３ ％ 。 ３ 关 键 词 ： 丙氨 酸 解氨 酶 ； 苯 重组 大 肠 杆 菌 ； 酵 ；Ｈ 发 ｐ
Ｅ Ｆ Ｃ Ｆ Ｈ Ｏ Ｈ Ｒ ＷＴ Ｎ Ｈ Ｎ Ｌ Ｌ Ｎ Ｎ ＭＭＯ Ｉ Ｙ Ｓ （ ） Ｆ Ｅ ＴＯ ＮＴ ＥＧ Ｏ Ｈ Ａ ＤＰ Ｅ Ａ Ａ Ｉ ＥＡ ｐ Ｙ Ｎ ＡＬ Ａ ＥＰ ＡＬ
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＿ ２ ２７ｏ８ｏ２ ＝ ６ ｏ ，１ ．． ＝ ｏＶ．Ｎ１ ２
霞品硪究与开 发
科研 学究
ｐ Ｈ对苯丙氨酸解氨酶 重组大肠杆菌生长及产酶的影响
崔建东 ， 贾士儒
（ 天津科技大学 生物工程学院 ， 天津 ３ ０ ５ ） ０ ４ ７
摘
要 ： 了提 高 重组 大肠 杆 菌苯 丙氨 酸 解氨 酶 的 产 量 和 活 力 ， 究 了发 酵 过 程 中 ｐ 对 重组 大肠 杆 菌的 生长 及 产 为 研 Ｈ
大肠杆菌代谢工程生产芳香族化合物研究进展
大肠杆菌代谢工程生产芳香族化合物研究进展李飞飞;赵广荣【摘要】芳香族化合物广泛应用于化工、食品及医药等领域,多来自于化工合成或天然产物提取.天然微生物也具有合成芳香族化合物的能力,以维持自身生命活动代谢需求,但其积累能力较低.近几年利用代谢工程的方法对微生物特别是大肠杆菌进行途径优化、设计、改造等方法在提高其芳香族化合物的发酵产量方面取得了显著成效,并且创新地生产出多种有价值的芳香族衍生物.这些研究成果对于未来以合成生物学和细胞工厂为基础利用可再生资源进行工业生物制造,解决化石能源危机和天然产物提取等问题具有重要意义.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2014(040)006【总页数】7页(P128-134)【关键词】大肠杆菌;代谢工程;芳香族化合物【作者】李飞飞;赵广荣【作者单位】天津大学化工学院制药工程系,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,天津,300072【正文语种】中文芳香族化合物广泛应用于化工、饲料、食品和医药等领域，其主要的来源是石油和煤焦油工业，化学合成是工业上生产芳香类化合物普遍采用的方法。
芳香族化合物也广泛分布于自然界，是各种生物的初级和次级代谢产物，所以也有一部分芳香族产品是通过生物法获得的。
近年来，随着环保要求的提高和化石能源的减少，利用生物法合成芳香族目标化合物成为研究的热点，其中微生物发酵法是通过优良的微生物菌种在合适的条件下以葡萄糖、甘油等可再生原料发酵积累芳香族化合物。
目前对于微生物中芳香族化合物的合成途径和调控机理研究最多且阐述最为清楚的是大肠杆菌。
大肠杆菌体内芳香族化合物的合成主要通过莽草酸途径(shikimate pathway)(图1)和其下游芳香族氨基酸进一步衍生化实现。
由于大肠杆菌自身积累芳香族化合物能力很低，只有代谢途径优化改造才能更好的实现目标产物的发酵生产。
近几年通过大肠杆菌代谢工程方法生产芳香族化合物取得了显著成效，极大地提高了目标化合物的合成积累能力，这为日后研究的进一步深入和工业化生产奠定了良好的基础。
粘红酵母产L—苯丙氨酸解氨酶发酵条件的优化研究
该 菌 种 由 本 公 司 筛 选 得 到 ， 鉴定 为 粘 红 酵 母 。 经
２ ．培 养 基
（） １ 反式 肉桂酸 含量用 ７ １分光光度计 测定 ５ （ ）－ 丙氨 酸用纸层析法测定 。 ２Ｌ 苯
三 、 果 与 讨 论 结
（ ） 面培养基 １斜 １ 。 ４Ｂ ０ 一１ ￣ｘ麦芽 汁加 ２ ％琼脂 配制而 成的固体培养基 。 ０
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内燃机进 排 粘 酵 缸 母产Ｌ苯 氨 解 酶 酵 件 优 研究 ．丙 酸 氨 发 条 的 化 噪声
黄建坡 朱 武 军
２ ０分 钟 。
一
、
前 言
Ｌ 苯 丙氨酸有生理活性 ， 人体和各种动物所必需 的。另外 Ｌ 一 是 一 苯 丙氨酸 又是合成一些抗癌药物 的中间体 。 最近 ｌ 来 ，一 ０年 Ｌ 苯丙氨 酸最重要 的用途是合成二肽甜味 剂阿斯 巴甜。
定 量 菌 泥 用 配 好 的 底 物 溶 液 定 容 到 １Ｏ ｌ 转 化 实 验 ， 化 ４ ０ ｒ ，做 ａ 转 ８小
对发酵条件进行优化研究 。
二 、 料 与 方 法 材 １ ．菌种
时， 比较 反式 肉桂 酸的消耗浓度或 Ｌ 苯丙氨酸的积 累浓度 ， 一 来确定
菌种酶活力 。
４ ．分析 方 法
动辐射产 生的外 ， 体动力也产生噪声 ， 气 而气 度 ， 而在气 门处显得十 分明显 （ 排气也 存在 类
体动力产 生的噪声又 包括进气 噪声 、排气 噪 似 分布 ） 。根据试验分析 ： 进气涡流噪 声的频 声和风扇噪声 。
一
率 计算公式如下 ：
Ｐ ｕ
、
进 、 气噪声产 生的原因及频率分布 排
３ ．培 养 方 法及 反 式 肉桂 酸 的 转 化 实验 将斜面上培养 ２ ４小 时 的 菌 体 接 种 于 种 子 培 养 基 ， 液 量 ２ ％ ，Ｆｓｈ ｒ 盐酸水解酪元 （ ａｅｎ 分离制 得 ９１ ｉ ｅ用 ｃ Ｃ Ｓ ｉ） Ｌ 苯 丙氯酸 ， ． 以后 Ｌ 苯丙氨酸 制备方法陆续出现 。 一 我们用含 Ｌ 苯丙氨酸解 氨酶 （ＡＬ ． Ｐ ）的粘红 酵母细胞在适 当条
重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件
重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件概述：
谷胱甘肽合成酶是一种重要的酶类蛋白，广泛应用于医学、食品、化工等领域。
本文将针对大肠杆菌的摇瓶发酵条件进行重新的优化，以提高谷胱甘肽合成酶的产量。
一、菌株选择及预处理
1.选用具有谷胱甘肽合成能力的大肠杆菌作为研究对象。
2.将菌株预处理后接种到摇瓶中。
二、培养基配制
1.基础培养基的配制：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、
10g/L葡萄糖、pH=7.2。
2.添加谷氨酰胺、L-半胱氨酸、硫酸镁等微量元素物质以提高谷胱甘肽合成功能。
三、发酵条件
1.发酵时间：选用24h、36h、48h等不同时间段进行观察和分析。
2.发酵温度：30℃、37℃、40℃等不同温度对菌株的产量影响。
3.振荡频率：发酵过程中的振荡频率可以促进氧气的输送，增加菌体的代谢效率。
四、收获和分析
1.收集并离心菌体，进行酶与蛋白质的提取。
2.利用SDS-PAGE对蛋白质进行检测，观察酶蛋白的表达情况。
3.利用UV-Vis光谱对酶活性进行检测，分析不同条件下产量的影响。
五、总结
上述方法有效地优化了大肠杆菌合成谷胱甘肽酶的生产条件，提高了酶的产量和活性，为谷胱甘肽合成酶的实际应用提供了有力保证。
此方法对于其他生物酶的生产也有一定的参考价值。
L-苯丙氨酸生产及应用研究进展
③ 其他领域
近年来, L- 苯丙氨酸的应用领域还在不断拓展, 如以L- 苯丙氨酸及其衍生 物为原料合成手性中间体技术；
五、L-苯丙氨酸的生产工艺
L-苯丙氨酸的制备方法主要有天然蛋白质水解法、化学合
成法、酶法、微生物发酵法。前三种方法主要存在着收率
低、成本高、对环境污染严重等缺点，未能得到进一步的 工业化应用，现在基本被淘汰。目前国内外主要采用发酵 法。
(2)加速限速反应，扩增表达L-苯丙氨酸合成代谢过程限速酶的基因。
苯丙氨酸的合成在许多关键点上受到调控,调控的途径多种多样, 通过关键酶基 因的克隆表达和去除产物苯丙氨酸的反馈抑制双重手段加速限速反应。如从苯丙 氨酸生产菌株中克隆了脱酶的DS、CM及PD酶基因, 并将它们串联起来, 克隆到 同一个多拷贝的载体上, 转移到色氨酸生产菌株中, 使代谢流向产苯丙氨酸方向转 移。
（一）L-Phe的生物代谢途径及其调控
L-苯丙氨酸合成的起始物为五碳糖磷酸途径的中间产物赤
藓糖-4-磷酸(E4P)和糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物称为3-脱氧--阿 拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP), 然后DAHP转化为莽草酸( SHIK), 然后再转化为分支酸( CHA), 由分支酸合成苯丙酮酸( PPY), 最后 苯丙酮酸经转氨作用生成L-苯丙氨酸。 苯丙氨酸合成途径有多调控位点，如图所示。其中
4 、微生物发酵法
发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-Phe的一种方法.发酵法 培养基有糖质的和非糖质的两种（一般采用苯丙酮酸、甲醇乙醇与乙酸 为原料），由于所使用的原料及菌种不同，致使发酵液中产物的含量相 差很大，要想获得苯丙氨酸的高效率，主要需要选择高产菌株及合理调 节代谢过程。 微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高、可大规 模生产等优点。 使用酵母菌生产L-苯丙氨酸从天然环境中分离到一株具有较高苯丙氨酸 氨解酶（PAL）活性的菌株，以此为出发菌株进行UV和EMS诱变处理， 所得菌株较原菌株酶活力有较大提高。大庆高新技术产业开发区邢军筛 选得到一种黏红酵母，该黏红酵母生产苯丙氨酸解氨酶最佳发酵条件为： 起始PH=5.5，接种量10 %（体积分数），温度28℃ ，发酵周期20h， 终点PH=8.0。
发酵法生产L-苯丙氨酸的研究进展 王凯
发酵法生产L-苯丙氨酸的研究进展摘要：L-苯丙氨酸(L-phenylalanine, L-Phe) 是一种广泛应用于食品、饲料添加剂以及医药等领域中的必需氨基酸，主要的工业生产方法为原料廉价易得，环境污染小的微生物发酵法。
综述了国内外发酵法生产L-苯丙氨酸的关键技术和策略以及最新研究进展情况。
关键词：L-苯丙氨酸；发酵法；基因工程技术；工艺优化1. L-苯丙氨酸的性质和用途苯丙氨酸(Phenylalanine)又称α-氨基化肉桂酸，分子式C9H11O2N，分子量165.19，属于带苯环的芳香族氨基酸。
最早由Schulze在1897年从羽扇豆幼苗中发现和分离，接着Fischer 于20世纪初由动物性蛋白质中成功分离得到[1]。
其光学异构体一共有三种，分别为L-型，D-型及外消旋D,L-型，其中的L-型具有生物活性，呈白色或无色的结晶粉末状，有苦味，常温下溶解度较低，为29.6g/L，并难溶于甲醇和乙醇等有机溶剂[2]。
L-苯丙氨酸在自然界广泛存在，但其含量都不高，在卵、乳和动物蛋白中，含量5~6%，在植物性蛋白质中含量占1%，石油蛋白中占到8%，单细胞蛋白中占3~5%[3]。
L-Phe还主要存在于纤维蛋白、蛋白及血红蛋白中，影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，还参与消除一些内脏的功能的损耗。
它是人体必需但自身无法合成的八种必需氨基酸之一，L-Phe的人体代谢障碍是一些先天性代谢疾病的病因，因此在医药行业中，L-Phe是一些氨基酸输液和营养剂中的必需成分。
除了直接用于合成医药外，还是医药类培养介质的配制中间体及载体，如抗肿瘤药物的药物载体。
在食品行业中，L-Phe可用于配制调味剂，强化营养作用。
自从20世纪80年代以来，由于食品双肽甜味剂阿斯巴甜（Aspartame，简称APM）的开发应用，L-Phe作为其合成原料之一，经济价值有了进一步的提高[4]。
2．L-Phe的生产方法随着市场需求的不断增长，L-Phe的生产受到越来越多的关注。
苯丙氨酸解氨酶综述2
苯丙氨酸解氨酶摘要：本文从前言介绍了PAL基本特性（基本性质、酶学性质和分子结构）、苯丙氨酸解氨酶的研究意义（植物生理代谢上的意义和医疗上的意义）、PAL 研究现状（产PAL微生物的选育及其稳定性研究和植物PAL基因的克隆与表达）和PLA 发展趋势四个方面对苯丙氨酸解氨酶进行综述。
Abstract: The article of phenylalanine ammonia lyase were reviewed from the basic characte- ristics of PAL (the basic nature of the enzymatic properties and molecular structure), the signifi -cance of the phenylalanine ammonia-lyase (the meaning of Plant Physiology and metabolism, and medical significance), PAL Researching (producing PALBreeding and stability of microbial and plant PAL gene cloning and expression) and the development trends of PLA.关键词：苯丙氨酸解氨酶、PAL基本性质、PAL酶学性质、PAL分子结构、植物生理代谢作用、细胞分化和木质化、植物色素形成、根瘤、抗逆境、抗虫性和抗病性、PAL选育、活性和稳定性研究、基因的克隆与表达、苯丙烷类代谢Key words:Phenylalanine ammonia lyase, the basic nature of the PAL, PAL enzymatic properties, the PAL molecular structure, plant physiology and metabolism, cell differentiation and lignification, plant pigments formed nodules, stress resistance, insect resistance and disease resistance, PALbreeding, activity and stability of gene cloning and expression of phenylpropanoid metabolism .一、前言1.PAL的基本特性1.1 PAL的基本性质苯丙氨酸解氨酶( phenylalanine ammonia- lyase, PAL,EC4. 3. 1. 5)是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。
苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养
《 现代食品科技》
Ｍｏ ｅｎＦ ｏ ｃ ｎｅａ ｄＴ ｃ ｎ ｌｇ ｄ ｒ ｏ ｄＳ ｉ ｃ ｎ ｅｈ ｏｏ ｙ ｅ
Ｖ １ ３Ｎ ．（ ９） ｏ ２ ｏ９总 ９ ．
苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆 菌的培养
崔 建东 ，谭之 磊，李飞 ，贾士儒 （ 天津科技 大学，天津市 工业微 生物 重点 实验 室，天津 ３０２） ０２２
（ｉ ｊ ｅ ａｏａｏｙ ｆｎ ｕｔ ｃｏｉｌｇ， ｉ ｊ ｎｖｒｔ Ｓｉ ｃ ｄ ｅｈ ｏｏ ， ｉ ｊ ０２２Ｃ ｉ ） Ｔａ ｉＫ ｙ ｂｒｔｒ Ｉｄ ｓｙ ｒｂｏｏｙＴａ ｉＵ ｉ ｓｙｏ ｃ ｎｅ ｎ ｃｎ ｌｇ Ｔａ ｉ３０２， ｈ ａ ｎｎ Ｌ ｏ ｒ Ｍｉ ｎｎ ｅｉ ｆ ｅ ａ Ｔ ｙ ｎｎ ｎ
Ａ ｓ ａｔ Ｉ ｒｅ ｒｖｏｄｒｏｉ ｏ ｅｔ ｉ ｄａ ｃｖｔ ｏ ｅ ｙ ｌ ｎ ａ ｒ ｔ ｍｐ ｈ ｅ ｎ ｉｙ ｐ ａ ｎ ｅ ｍｍｏ ｉ ｌ ｅ（Ａ ） ｒｄ ｃｄｂ ｃｍｂ ａ ｔ ｃｌｓａ ，ｈ ｎａ ｙ ａ Ｐ Ｌ ｐｏ ｕｅ ｙｒ ｏ ｉ ｎ 最 ｏ ｉ ｔ ｓ ｅ ｎ ｉｗ ｎ ｅ
摘要： 了 高 丙 为 提 苯 氨酸解氨酶的产量和活力， 高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基 因的重组大肠杆 菌 Ｊ ０ 进行培养， 对 Ｍ１ ９ 优化了发酵培养基成分， 养条件 以 培 及发酵工艺，结果表明 ， 最佳葡萄 糖浓度为 ２ Ｌ 碳 氮比为 ７ ６ ０ ｒ， ｇ ． ，添加 ５ ｒ酵母粉和蛋白胨 ８ Ｌ ｇ
有利于菌体产酶，最佳发酵液初始 ｐ Ｈ为 ７５ ．，接种量为 １ ０％。通过 ＿４ ４ ，重组犬肠杆 菌培养 １ ＬＬ￣ ８ｈ时酶活可达到 ７ ％（ Ｃ ０， ０ Ｕ Ｄ￣
酶 活 比原 工 艺提 高 了 １ 倍 。 ． ６
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定一、目的掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。
二、原理苯丙氨酸解氨酶（l-phenylalanine：ammonialyase,缩写pal；ec4.3.1.5）就是植物体内苯丙烷类新陈代谢的关键酶，与一些关键的次生物质例如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等制备紧密有关，在植物正常生长发育和抵挡病菌侵犯过程中起至关键促进作用。
pal催化剂l-苯丙氨酸水解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm处为最小稀释值。
若酶的重新加入量适度，a290增高的速率可以在几小时内维持维持不变，因此通过测量a290增高的速率以测量pal活力。
规定1h内a290减少0.ol为pal的一个活力单位。
三、试剂和材料(1)0.lmol硼酸一硼砂缓冲液(ph8.7)(2)酶提取液0.1mol/i硼酸一硼砂缓冲液（含1mmol/i,edta,20mmol/lβ一巯基乙醇）（3）0.6m.ol/i-l一苯丙氨酸溶液（4）6mol/lhcl(5）固体硫酸铵(6）0.02mol/l-磷酸盐缓冲液（ph8.0,含0.5mmol/ledta,2.5%甘油，20nlmol/l.β-巯基乙醇）（7）sephadexg一25（8）deae纤维素52（9）标准蛋白质溶液（100ug/ml）：精确称取10mg牛血清自蛋自于烧杯内，用蒸馏水熔化，全然迁移至100ml容量瓶内，定容至刻度，搅匀。
（10）托福马斯亮蓝g-250蛋白质染色液：称取10mg托福马斯亮蓝g-250,溶5ml95`%乙醇中，重新加入85％（w/v）磷酸loml，搅匀后即为母液。
用时，按15ml母液提85m1蒸馏水的比例吸收，搅匀后过滤器即为为稀释液。
（11）滴管(l2)木患夹材料：供试植物材料四、操作步骤（1）酶液抽取植物材料lg，剪大段，重新加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上研钵研磨。
(2)将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。
滤液转入离心管，10000g冷冻离心30分钟。
L_苯丙氨酸生产菌株的构建代谢调控和发酵条件优化 (2)
❖ 一 发酵法生产 L-Phe 的重组质粒的构建 ❖ NTG 诱变及抗β-2-噻吩丙氨酸突变菌株的筛
选
❖ 重组质粒的构建
❖ 转化子的筛选与鉴定
❖ 重组质粒的序列分析 ❖ 重组大肠杆菌的培养 ❖ 酶活性检测 ❖ 质粒稳定性检测 ❖ L-Phe 产量的测定
❖ 二 噬菌体的分离、纯化及抗噬菌体大肠杆 菌的筛选
1.1 应用现状及存在的问题
❖ 国内外研究人员在微生物发酵法生产L-Phe 的研究中进行了大量的工作并取得了一些重 要研究成果，一些改良的菌株及技术已成功 应用于L-Phe的工业化生产中。然而，相比 于其它种类的氨基酸，L-Phe的生产得率仍 然较低，已有很多研究者尝试了不同的方法， 但目前仍停留在理论研究或实验室规模的发 酵阶段。
❖ 在培养过程中改变培养温度（设三个温度梯 度）
❖ 分析不同的诱导温度发酵动力学参数的变化 趋势。（酶活、L-Phe产量、菌体浓度、质 粒的稳定性等）
❖ 结果分析
四. 研究创新点及难点
创新点
工艺优化 对重组的抗噬菌 体菌株菌株采取 三阶段温度诱导 策略，进一步提 高了其对碳源的 得率，提高了产 量
BACK
二、实验内容
发酵生产 L-Phe的重 组质粒的
构建
实验内容
诱导温度对重 组菌发酵生产 苯丙氨酸的影
响
抗噬菌体 大肠杆菌
的筛选
1. L-苯丙氨酸的合成途径和关键 酶调控
❖ 在研究中，我们从E. coli 抗β-2-噻吩丙氨酸 的突变株中获得一个新的pheAfbr基因，该基 因将有可能为CM-PDT对L-Phe的反馈抑制敏 感性机制的研究提供有用的信息，并有助于 改进菌株生产L-Phe的能力。分析其突变位 点和方式，并在低拷贝、温度诱导表达的质 粒中克隆、表达该基因和aroF基因以促进LPhe的过量合成。
苯丙氨酸氨解酶基因
淀纯化，溶于双蒸水。
•
按文献描述步骤用T4DNA连接酶将2.5kb rPAL-1-
cDNA与5'端脱磷酸之线性pET-28c连接重组成表达质粒，
连接时取插入片段DNA与pET-28c DNA的摩尔比为3∶1。
连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3, 在含有卡那霉素
的LB平板上,筛选出阳性克隆。
获取工程菌的过程
谢谢
构必需具备与之相匹配的ATT框架。对比大肠杆菌表达质
粒pET-28a, b, c部分序列，发现在重组后，能保持正确阅
读框架，而不发生移码的只有pET-28c符合要求。若rPAL-
1-cDNA正向插入pET-28c 多克隆位点上的EcoR I位点，
预期重组后的表达质粒部分序列应如图1所示。
获取工程菌的过程
苯丙氨酸氨解酶基因
苯丙氨酸氨解酶简介
• 缩写PAL。是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式 桂皮酸的酶。EC．4．3．1．5。是1961年J．Koukol， E．Conn在大麦中发现的。存在于高等植物、酵母、菌类 的可溶性部分。推测分子量为30万。这是一个可把苯丙氨 酸用于酚类化合物合成的酶。在很多情况下，其反应成为 酚类化合物合成的有步骤的速率阶段。在组织中的活性可 随外界因素而发生显著变化，用光照，病伤害，植物激素 处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。 在多数情况下，在组织中活性增加的同时，酶发生失活作 用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为， 这种失活是与类蛋白质物质作用有关。此外也已指出有非 活性的酶的存在。
获取工程菌的过程
• 目的基因的获取
获取工程菌的过程
• 二、重组子的制备及酶切分析：
•
rPAL-1-cDNA大小为2519 bp，pET-28c大小为5367
苯丙氨酸解氨酶的研究进展
Ｎｏ．７．２００６ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈｏｎｔｅｓｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＰＳ１）ｇｅｎｅｆｒｏｍＳａｃ－ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌｓ，２０００，１０（３）：２６３－２６８［１６］ＡｊａｙＫ．Ｇａｒｇ，ＪｕｋｏｎＫｉｍ，ＴｈｏｍａｓＧ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅａｃ－ｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｃｏｎｆｅｒｓｈｉｇｈｔｏｌｅｒａｎｃｅｌｅｖｅｌｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｌｌＡｃａｄＳｃｉ，２００２，９９（２５）：１５８９８－１５９０３［１７］张树珍，郑学勤．基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报［Ｊ］．热带作物学报，２００１，２２（１）：３５－４１［１８］王自章，张树珍，杨本鹏，等．甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株［Ｊ］．中国农业科学，２００３，３６（２）：１４０－１４６［１９］赵恢武，陈杨坚，胡莺雷，等．干早诱导性启动子驱动的海藻糖－６－磷酸合酶基因载体的构建及转基因烟草的耐早性［Ｊ］．植物学报，２０００，４２（６）：６１６－６１９苯丙氨酸解氨酶（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ，ＥＣ．４．３．１．５）广泛存在于各种植物和少数微生物中，催化Ｌ－苯丙氨酸（Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｌ－Ｐｈｅ）脱氨生成肉桂酸和氨，是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶。
在植物形成次生物质如木质素、植保素等中起重要作用，对植物生长发育、抵御病虫害、防紫外辐射及构成植物支撑系统等方面具有重要意义。
自Ｋｏｕｋｏｌ首次从绿色植物中发现并分离纯化出苯丙氨酸解氨酶的研究进展贺立红１，２，张进标３＊，宾金华３（１．仲恺农业技术学院生命科学学院，广州５１０２２５；２．华南农业大学园艺学院，广州５１０６４２；３．华南师范大学生命科学学院，广州５１０６３１）摘要：对苯丙氨酸解氨酶的分布、基本特性、分子结构、各种因子对其活性的影响和生理功能方面作了简要的概述，旨在为该酶的进一步研究提供参考。
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苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶条件研究崔建东，张云峰，李 艳(河北省发酵工程研究中心，河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018)摘 要：为了提高重组苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力，研究培养基初始pH 值、种龄、接种量、装液量和发酵时间对重组PAL 活力的影响，并用响应面分析法优化了培养条件。
单因素最适培养条件为：发酵培养基初始pH7.0、种龄10h 、接种量10%、装液量50ml 、发酵时间24h 。
响应面优化后的结果表明，种龄、接种量和发酵时间对重组PAL 活力影响较大，但三者之间没有显著的交互作用。
优化后的产酶条件是：种龄13.3h 、接种量10.7%、发酵时间25.5h 、在此条件下，PAL 活力比不优化的培养条件的酶活增加了15%左右，重组PAL 酶活达到14.95 U/m l 。
关键词：苯丙氨酸解氨酶；重组大肠杆菌；培养条件；响应面分析Optimization of Production Conditions of Phenylalanine Ammonia-Lyase by Recombinant E.coliCUI Jian-dong ，ZHANG Yun- feng ，LI Yan(Hebei Fermentation Engineering Research Center, College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science andTechnology, Shijiazhuang 050018, China)Abstract ：Effects of initial pH value of fermentation medium, inoculation time, inoculation volume, broth volume in 250-ml flask and fermentation time on the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) produced by recombinant E. coli JM109 were investigated through single-factor test, and then the main affecting factors confirmed in single-factor test were optimized through response surface analysis (RSA). The results showed that initial pH value of fermentation medium and broth volume in 250-ml flask are not main affecting factors, and they can be controlled at 6.5 to 7 and 50 ml, respectively; inoculation time, inoculation volume and fermentation time are main affecting factors, and their optimal levels are 13.3 h, 10.7 % and 25.5 h, respectively. By this optimization, the activity of PAL is increased by about 15%, reaching 14.95 U/ml.Key words ：phenylalanine ammonia-lyase ；recombinant E. coli ；culture conditions ；response surface analysis 中图分类号：Q946.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)07-0181-05收稿日期：2008-06-09基金项目：河北科技大学自然科学基金项目(XL200763)作者简介：崔建东(1974-)，男，讲师，博士，研究方向为生物反应工程。
E-mail ：cjdoo7cu@苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase ，PAL ，EC4.3.1.5) 可以抑制某些肿瘤，治疗苯丙酮尿患者，其主要作用是催化反式肉桂酸转化生产L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸是合成新型甜味剂阿斯巴甜的主要原料[1-2]。
在大多数高等植物、部分丝状真菌、 酵母和某些链霉菌中都含有PAL [3-4]。
但L-苯丙氨酸生产中所用的PAL 酶主要来自红酵母属。
在生产过程中，由于红酵母的P A L 产量低，酶活迅速下降，极大的限制了L-苯丙氨酸的生产。
为了改善这种情况，一些学者在红酵母培养过程中，利用不同的氨基酸作为诱导物来提高PAL 产量[5-6]。
还有一些学者通过改善红酵母细胞通透性来提高PAL 酶活[7-8]。
一些学者试图用PAL 重组大肠杆菌高效表达合成PAL [9-10]。
虽然红酵母PAL 在大肠杆菌中得到高效表达，但重组PAL产量和活力仍然较低，不足以工业化生产。
在以前的研究中，尽管已经优化了PAL 重组大肠杆菌产酶培养基[11-12]，但对重组PAL 大肠杆菌产酶条件的研究基本没有报道。
因此，优化P A L 重组大肠杆菌产酶条件，提高重组PAL 活力是急需开展的工作。
本研究重点探讨了不同的培养条件对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌产酶的影响，并利用响应面分析法优化了产酶条件，以获得较佳的产酶条件，提高重组P A L 产量和活力。
１材料与方法1.1材料与试剂重组大肠杆菌JM109 (含有质粒PBV220-PAL、携带PAL基因，Amp抗性)，参考文献[13]方法构建。
圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因被克隆进入表达质粒PBV220(中国北京306医院李建欣惠赠)，PAL的表达被启动子Tac和PRPL控制。
蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、氨苄青霉素、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、柠檬酸、乙二胺四乙酸、氯化钴、氯化锰、氯化铜、硼酸、高锰酸钠、乙酸锌、浓盐酸、双(三(羟甲基))氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化胺、L-苯丙氨酸、反式肉桂酸。
1.2仪器与设备PHS-25 型雷磁数显pH计、752紫外光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司；DSHZ-300型水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备；VS-1300-U超净工作台江苏苏净集团安泰公司；FA2004电子天平上海精科天平有限公司；TDA-8002恒温水浴槽天津中环科技开发公司；YXQG01高压蒸汽灭菌锅山东新华医疗器械厂；YXQG01低速离心机北京医用离心机厂。
1.3培养基种子培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 1、葡萄糖1、氨苄青霉素0.5，pH7.0；发酵培养基(g/L)：葡萄糖20、磷酸二氢钾13.3、磷酸氢二铵4、硫酸镁1.2、柠檬酸 1.7、氯化锰15 、氯化铜1.5、硼酸3 、高锰酸钠2.5、乙酸锌13、乙二胺四乙酸8.4mg/L、氢化钴2.5mg/L，pH7.0。
1.4方法1.4.1培养方法将活化后的菌种1ml转入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min条件下摇瓶培养12h。
以10%接种量将种子培养液接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、200 r/min条件下摇瓶培养16h，42℃诱导表达4h后在30℃培养直到测酶活。
1.4.2酶活的确定取10ml重组大肠杆菌培养液4 000r/min离心10min，去离子水冲洗两次后，用10ml 浓度为25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)悬浮菌体沉淀，得到菌悬液。
PAL酶活性的测定：测定方法见文献[14]，一个酶活单位定义为每分钟转化1mmol L-苯丙氨酸成为肉桂酸的所用酶量。
PAL比酶活表示为每毫升发酵液含有的活力单位数。
取1ml菌悬液，用0.5g/L的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)在30℃处理30min，4000r/min离心10min，用去离子水冲洗两次菌体沉淀，离心，菌体沉淀中加入2.5ml 50mmol/L L-苯丙氨酸溶液、2ml 25mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，在30℃保温10min，加入6mol/L HCl 0.2 ml终止反应，4000r/min离心10min，在752分光光度仪上测定上清液的吸光度A278nm。
根据反式肉桂酸标准曲线得出生成的反式肉桂酸质量浓度，获得每次反应的酶活。
酶活性的计算公式：C VU=———Mw・t式中：C为反式肉桂酸质量浓度；V为反式肉桂体积；M w为反式肉桂酸分子量；t为反应时间。
1.4.3试验设计试验以PAL酶活为考核指标，分别对发酵培养基初始p H值、接种时间、接种量、装液量和发酵时间进行单因素试验，在单因素试验的基础上利用响应面方法对PA L产酶条件进行优化。
1.4.3.1单因素试验发酵培养基初始pH值的选择：分别将发酵培养基的初始p H值调为6、6.5、7、7.2、7.5，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳初始pH值的发酵培养基。
接种时间的选择：分别选择培养种龄在8、10、12、14、16h的种子接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳接种时间。
接种量的选择：以培养10h的种子按5、8、10、12、15%(种子液:发酵培养基，V/V)的接种量接种，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，以1.4.1的培养方法培养后检测P A L酶活，获得最佳接种量。
装液量的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%接种初始pH值为6.8的发酵培养基(发酵培养基在三角瓶中装液量分别为25、50、75、100、125m l)，以1.4.1的培养方法培养后检测PAL酶活，获得最佳装液量。
发酵时间的选择：选择种龄为10h的种子、接种量为10%，接种初始pH值为6.8的发酵培养基，在三角瓶中装液量为50ml。
发酵时间分别为20、22、24、26、28h后检测P A L酶活，获得最佳发酵时间。
1.4.3.2响应面实验优化PAL产酶条件根据单因素试验结果，选择因素中有意义的水平进行响应面分析实验，对结果进行分析，并获得最佳的P A L产酶条件。
利用R S M软件，以接种量、种龄和发酵时间为因素，选择三个水平进行实验。
２结果与分析2.1初始pH值对PAL酶活性的影响由图1可知，当初始pH值在6.5～7之间时，重组PAL 的酶活力较高，低于或高于这个范围酶活都受到抑制。